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目的:构建LIF和IL-24双基因共表达腺病毒载体(Ad-LIF-IL-24),研究其对胶质瘤细胞的抑癌增效和分子机制。方法:分别以pORF-mbcl-2α质粒为模板,PCR分别扩增出polyA和promoter基因片段,再以此为模板,经SOE-PCR扩增polyA+promoter(SalI、NotI)融合片段,并突变其中的PacⅠ酶切位点。再以pcDNA3.0-LIF质粒和pAdTrack-CMV-IL-24质粒为模板,PCR扩增出LIF(BglII、SalI)和IL-24(XhoI、XbaI)目的片段,并与突变后polyA+promoter(简称polyA+promoter△)依次亚克隆至pAdTrack-CMV转移质粒构建pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter△-IL-24双基因共表达重组转移质粒。将构建正确的pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter△-IL-24重组转移质粒经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到的同源重组质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-LIF-polyA+promoter△-IL-24(简称为pAd-LIF- polyA+promoter△-IL-24)经PacI酶切后再用脂质体转染QBI-293A细胞,经多轮感染和扩增后获得Ad-LIF-polyA+promoter△-IL-24(简称Ad-LIF-IL-24)双基因共表达重组腺病毒载体。将Ad-LIF-IL-24体外感染肿瘤细胞SMMC-7721、U251、HT29、A549、HL-60、K562和正常细胞WI-38,筛选出Ad-LIF-IL-24最敏感肿瘤细胞和最佳感染剂量。MTT法和FCM检测Ad-LIF-IL-24对敏感肿瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡的增效作用,Hochest染色进一步检测肿瘤细胞凋亡的核形态特征,用RT-PCR检测与细胞凋亡和肿瘤血管形成相关基因bcl-2、bax、ICE、p53和HIF-1α的转录,Western blotting检测肿瘤细胞中的细胞凋亡执行蛋白Cleaved Caspase3的表达。结果:成功构建了双启动子介导的LIF和IL-24双基因共表达腺病毒载体Ad-LIF-IL-24。Ad-LIF-IL-24均能高效感染实体瘤细胞和正常人胚肺二倍体成纤维细胞WI-38,但对白血病细胞感染效率很低,并且对U251胶质瘤细胞抑制作用最为明显,最佳感染剂量为100MOI。腺病毒介导的LIF和IL-24双基因共表达在体外能明显抑制U251胶质瘤细胞生长和诱导凋亡,并呈现叠加效应。分子机制检测结果表明:Ad-LIF-IL-24能明显上调U251胶质瘤细胞ICE、bax、p53和下调bcl-2、HIF-1α等基因的转录,并激活Caspase3剪切成Cleaved Caspase3片段。结论:成功构建的LIF和IL-24双基因共表达腺病毒载体Ad-LIF-IL-24体外能明显抑制U251胶质瘤细胞生长和诱导其凋亡,并呈现叠加作用。Ad-LIF-IL-24可通过上调U251细胞中ICE、bax、p53和下调bcl-2等细胞凋亡相关基因促使Caspase3激活以及下凋与肿瘤血管形成密切相关的HIF-1α基因等途径抑制U251胶质瘤细胞的生长和诱导其凋亡。