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胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)是由肠道L细胞分泌的一种肠肽激素,具有多种生理功能,有显著的血糖浓度依赖的刺激胰岛素分泌作用,可以降低空腹和餐后血糖,在2型糖尿病的临床治疗中具有较好的应用前景。但由于GLP-1在体内半衰期很短,被二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-IV)的快速降解和肾脏代谢作用,使其临床应用受到了很大限制。因此,开发更稳定的新型GLP-1类似物或缓释制剂,延长其体内有效作用时间已成为近年来关注的热门课题。本文首先构建纤维素结合域(CBD)与链霉亲和素(SA)的融合蛋白,制备了表而生物偶联SA的纤维素磁性微球(SA-CBD-MCMS),通过生物素(biotin)结合的Oligo(dT),建立了从细胞或组织中快速提取mRNA的方法,并从大鼠胰腺中提取mRNA,克隆了大鼠GLP-1受体(GLP-1R)。并将含有GLP-1 R基因的重组表达载体pcDNA3.1(+)/GLP-]R转染含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的CHO/EGFP细胞,经抗性筛选、流式细胞分选和功能性分析,得到了稳定转染的细胞系CHO/EGFP/GLP-1R。该功能性报告基因细胞分析系统可以剂量依赖性的通过EGFP表达,对GLP-1 R激动剂的体外活性进行定性定量分析,为研究、开发和评价长效GLP-1类似物奠定了基础。本研究创新性地合成了含有31个氨基酸的新的GLP-1类似物KGLP-1,其结构是在天然GLP-1(7-37)酰胺的N端添加一个赖氨酸(Lys)。利用上述CHO/RGFP/GLP-1R细胞评价体系及自制DPP-IV粗酶液对KGLP-1的体外活性和稳定性进行分析。结果显示,KGLP-1能以剂量依赖的方式激活GLP-1 R,其EC50值(2.44 nmol/L)与天然GLP-1 (0.83 nmol/L)相比略有升高：但KGLP-1具有显著的抗DPP-Ⅳ降解作用,与DPP-Ⅳ粗提物作用12h后仍能保持80%的活性。进步体内活性分析结果表明,KGLP-1能以剂量依赖的方式显著降低小鼠体内的血糖水平,在同等剂量下,给药2h后仍具有明显的降血糖和促胰岛素分泌作用,而天然GLP-1在给药1h后活性即消失。在糖尿病模型小鼠实验中,KGLP-1也同样显示出了明显的降血糖作用(p<0.01)。为了改善KGLP-1的肾脏清除,本研究制备了KGLP-1与HSA的融合蛋白KGLP-1/HSA,并对其体内外活性、稳定性进行了分析。体外分析结果表明,KGLP-1/HSA具有与GLP-1相似的GLP-1R激动剂活性,EC50值为314 nmol/L,虽然其活性低于天然的GLP-1及类似物KGLP-1,但显示了明显的抗DPP-Ⅳ降解作用,12 h后仍能刺激CHO/EGFP/GLP-1R细胞产生较强的荧光,其强度为原来的84%。体内活性分析结果表明,虽然KGLP-1/HSA在给药后1h才表现出明显的降血糖、促胰岛素分泌的作用,但这种活性可以维持8h以上,而GLP-1与KGLP-1在给药1至2h后效果即不显著。以上结果表明,通过与HSA的融合,KGLP-1/HSA能明显地减缓其体内代谢清除率,延长其体内作用时间。此外,本研究还对KGLP-1的注射缓释制剂进行了探索。利用复乳(W/O/W)溶剂挥发法制备了载KGLP-1的PLA和PLGA微球,分别考察了高聚物的种类、平均分子量等因素对微球形态、平均粒径、包封率和体外释药特性的影响。结果发现,该类微球的包封率都小于40%,药物损失大。而采用S/O/O溶剂萃取法制备的载KGLP-1的PLGA长效注射微球其形态特征、包封率、体外释药均显示了较好的结果。电镜分析显示微球表面相对光滑致密,大小均一,平均粒径为33.5μm,包封率为85.5%,微球初始6h的突释为15.3%,14d的累计释放总量达到69.5%。采用糖尿病模型大鼠皮下注射给药,对血糖和血清胰岛素水平的考察结果显示,载有KGLP-1的PLGA微球可以提供稳定的药物释放,实现了给药一次,缓释10 d,控制血糖、促进胰岛素分泌的效果。本论文以自行开发的SA-CBD-MCMS为工具,提取大鼠胰腺mRNA,克隆了大鼠GLP-1R。然后以GLP-1R为靶点构建了含有EGFP报告基因的功能性细胞分析系统CHO/EGFP/GLP-1R,以此作为GLP-1R激动剂体外活性评价的细胞模型。利用该模型对新型GLP-1类似物KGLP-1及其与HSA的融合蛋白KGLP-1/HSA进行体外活性、稳定性评价,结合KM小鼠、糖尿病模型动物的体内实验,证明了KGLP-1作为一种新的抗DPP-Ⅳ降解的GLP-1类似物的有效性,并通过与HSA的融合,可以延长其降低血糖、促进胰岛素分泌的作用时间。同时,采用PLGA为包埋材料,S/O/O溶剂萃取法成功制备了载KGLP-1的缓释微球制剂,实现了长效治疗的效果,为开发能够用于2型糖尿病临床治疗的长效GLP-1类药物及其缓释制剂奠定了理论基础。