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背景与目的肠激酶(enterokinase,EK)是一种丝氨酸蛋白水解酶,广泛存在于的哺乳动物十二指肠粘膜,专一性的水解胰蛋白酶原,使其转化为具有活性的胰蛋白。它由两个亚单位(重链和轻链)组成的二聚体分子,两条链间由一个二硫键相连。其中重链作用是锚定在细胞膜上,轻链是酶的催化活性中心,能够专一识别(Asp)4~Lys氨基酸序列、并水解氨基酸Lys后的肽键。因为它的轻链能够专一识别DDDDK氨基酸序列、并水解氨基酸“K”后的肽键,在体外能够裂解融合蛋白。同时肠激酶反应的条件非常广,在很宽的温度和pH范围都具有酶解活性,酶解后的目标蛋白保留了天然蛋白氨基酸序列,所以近年来肠激酶在基因工程中的利用越来越广泛。当我们在进行大肠杆菌表达外源蛋白时,由于目标蛋白固有的特性使其在原核生物细胞内表达困难或者后继的蛋白纯化困难,为此在目的基因的前面融合更加利于表达和纯化的前导蛋白(前导蛋白-DDDDK-目标蛋白),使我们在进行蛋白表达和纯化是能够更加简单方便,使目标蛋白表达量更高,更利于纯化。现在国外有试剂公司销售高质量的EK酶,但价格昂贵,不利于大规模生产目标蛋白,不能满足现在大规模的使用。为了解决当前面临的问题,我们进行了酵母的克隆表达,弥补国内的空白,降低生产蛋白药物的生产成本。实验方法根据GenBank登记(accession L19663)的牛肠激酶基因序列,我们设计了合成全基因PCR引物,根据PCR引物相互配对的原理进行人工合成牛肠激酶轻链基因cDNA。用EKL基因两端带有特殊酶切位点的引物扩增EKL基因进行T载体(pMD18-T vector)连接,选择阳性克隆(pMD18-T/EKL)进行序列测定,将测序正确后的基因插入甲醇酵母分泌型载体pPICZαA,得到重组质粒pPICZαA/EKL,重组载体经线性化后转化Pichia pastoris SMD 1168H,筛选得到重组牛肠激酶轻链基因工程菌。分别对重组酵母工程菌进行高密度发酵、rEKL (recombinant enterokinase light chain, rEKL)纯化、N端序列测定、生物学活性鉴定等研究工作。实验结果重组牛肠激酶轻链基因工程菌发酵上清中rEKL含量高,纯化的rEKL专一性强、无其他杂酶活性、N端15个氨基酸序列与文献报道一致。