磷脂翻转酶属于P型ATP酶超家族P4-ATP酶亚家族,绝大部分与CDC50家族蛋白形成二聚体,将磷脂从生物膜的胞外侧转运到胞浆侧,在膜磷脂不对称性分布、脂质清除和囊泡形成等方面发挥重要作用。与其他以阳离子为底物的经典P-型ATP酶一样,磷脂翻转酶也遵循Post-Albers循环,在转运过程中发生自身磷酸化和去磷酸化。目前,磷脂翻转酶转运磷脂的分子机制仍然不甚清楚,在本研究开始时,磷脂翻转酶的结构尚未被解析。理化性质与阳离子截然不同的磷脂分子如何被P4-ATP酶转运、转运的具体路径、转运过程中磷脂翻转酶的构象变化以及磷脂翻转酶的活性调控等都是这个领域需要解决的重要问题。此外,磷脂翻转酶本身就处于由底物磷脂所组成的脂双层中,解析其在脂双层中的结构更接近生理状态。本研究利用冷冻电镜单颗粒分析技术对处于脂双层环境下的磷脂翻转酶进行结构生物学研究,以揭示其转运磷脂的分子机制。研究首先在酿酒酵母中成功表达提纯了嗜热毛壳菌（Chaetomiumthermophilum,Ct）的磷脂翻转酶CtDnf1-CtCdc50,并重建于nanodisc中,分别添加BeF3-或AMPPCP将其富集在E2P或E1-ATP状态,利用冷冻电镜技术,获得分辨率为3.5?（E2P）和3.4?（E1-ATP）的两个结构。结构表明CtDnf1的执行结构域存在大幅度位移,与其直接相连的TM1在E1-ATP状态下不可见,同时nanodisc脂双层发生局部形变。CtDnf1中存在一条由TM2、TM4和TM6构成的连续亲水性跨膜沟槽,在E2P状态下沟槽内鉴定到两个磷脂分子结合位点,其中一个位点未曾被报道。研究据此提出一个新的磷脂转运模型:CtDnf1-CtCdc50的跨膜区随胞质结构域的移动发生较大构象变化,使磷脂分子被跨膜沟槽内多个结合位点相继传递,经过两个工作循环从胞外侧转运到胞内侧。接下来研究转向酵母（Saccharomycescerevisiae）的磷脂翻转酶Dnf1p-Lem3p。去垢剂中解析的E2P（2.8?）和E1-ATP（3.1?）结构表明,Dnf1p-Lem3p的结构与其他P4-ATP酶相似。但是重建于nanodisc的结构显示,不论添加BeF3-（3.8?）还是AMPPCP（3.2?）,Dnf1p都采取一种未曾报道的特殊构象。在这种构象中,Dnf1p的执行结构域远离其他胞质结构域,TM1和TM2交换相对位置,TM4由局部解开的螺旋变成一个长α-螺旋,亲水性跨膜沟槽的连续性被破坏。生化实验表明酵母细胞中确实存在这种不处于工作循环的静息态。将nanodisc的脂质成分由酵母磷脂改为90%PS-10%PC后,Dnf1p又能够通过添加BeF3-和AMPPCP获得与去垢剂中相似的E2P（2.9?）和E1-ATP（3.7?）结构。研究据此提出静息态为Dnf1p自身活性调控的一种机制。综上所述,本研究解析了磷脂翻转酶在脂双层中多种状态的结构,提出了一个可能的磷脂转运模型以及活性调节机制,为继续深入研究磷脂翻转酶的工作机理提供了重要的结构线索,未来还需要继续研究磷脂翻转酶的调控机制以及底物特异性等。