食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因检测和基因分型研究

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目的:1建立食源性金黄色葡萄球菌14种肠毒素基因的多重PCR检测方法,调查石家庄地区食源性金葡菌中肠毒素基因的分布状况。2设计食源性金葡菌的MLVA分型方法,比较MLST、MLVA、PFGE三种基因分型方法在食源性金葡菌基因多样性研究中的优劣势。方法:1对93株食源性金葡菌进行复苏传代培养,用试剂盒提取基因组DNA;2设计14种肠毒素基因A、B、C、D、E、G、H、J、K、L、M、N、Q、U的PCR引物,通过优化反应条件确定多重PCR反应体系,对石家庄地区分离的93株食源性金葡菌进行肠毒素基因的检测;3参考相关文献,结合网站数据设计金葡菌的MLVA分型方法。应用MLST、MLVA、PFGE三种方法分别对26株食源性金葡菌进行基因分型,对分型结果进行对比分析。结果:193株食源性金葡菌均成功复苏,提取的基因组DNA浓度和纯度均符合实验需求。2设计的14种肠毒素基因PCR引物除SEE外,均扩增到了目的基因片段,双向测序结果在GeneBank上进行BLAST比对,证实为肠毒素基因的目的片段。3设计优化的多重PCR反应体系能够成功扩增到食源性金葡菌的肠毒素基因目的片段,经检测,93株食源性金葡菌中79株检出含有肠毒素基因,肠毒素基因的检出率为84.95%;其中检出SEA的有55株(59.14%),SEG32株(34.41%),SEM32株(34.41%),SEK25株(26.88%),SEB22株(23.66%),SEU21株(22.58%),SEN20株(21.51%),SEH16株(17.20%),SEJ15株(16.13%),SEC14株(15.05%),SED13株(13.98%),SEQ13株(13.98%),SEL7株(7.53%);此外,57株金葡菌(61.29%)被检出同时含有两种或两种以上肠毒素基因,其中有1株检测到同时含有10种肠毒素基因,3株检测到同时含有9种,3株检测到同时含有8种。4MLST分型将26株金葡菌分成8个ST序列型,其中ST59型11株,均来自同一起食物中毒分离获得的菌株;ST5型5株,ST464型3株,ST7型和ST15型各2株;此外还获得了一个新发现的ST序列型,已提交MLST国际数据库进行确认并收录。5设计的MLVA方法具有较好的分型力和可重复性,26株食源性金葡菌经此方法成功分为10个基因型,其中VA05型11株,均为一起食物中毒中分离的菌株,VA07型4株,VA01型、VA09型和VA10型各两株,其他各一株。6PFGE分型将26株金葡菌分为9组共13个基因型,其中A组共11株,均为一起食物中毒中分离的菌株,B组有4个亚型共4株,C组有两个亚型共3株,D组和E组各两株,其他组各一株。结论:1设计的14种肠毒素基因PCR引物以及多重PCR反应体系具有较好的稳定性,能够用于食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因的快速检测。2MLVA的分型力较MLST强,但是不及PFGE。3与MLST和PFGE相比,设计的MLVA分型方法具有快速简便、稳定性好、分型力较高等优点,可用于食源性金葡菌的快速基因分型。
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