近年来,高灵敏、高特异性核酸检测在传染性疾病的诊断、微小RNA分析、食品监控、表观遗传学、法医鉴定中人体身份的识别及生物医药研究方面得到快速发展应用。而痕量DNA的检测在基因治疗、突变分析和临床诊断方面显得尤为重要,定量检测痕量DNA的方法大部分依赖于各种信号放大方法,例如酶辅助信号放大、杂交链反应、链置换反应、等温指数放大、滚环放大方法等。其中酶辅助信号放大方法由于其高灵敏度、高选择性的优点而备受人们关注,该方法不但提高了生物传感器检测方法的灵敏性,而且实验操作简单、快速,能够用于均相溶液中。本文旨在进一步拓展生物传感器在核酸及小分子中的分析应用,基于外切酶辅助信号放大及运用荧光染料分子选择性结合G-四链体增强荧光的特性,本文构建了荧光/荧光偏振生物传感器分别用于核酸(DNA)、腺苷三磷酸(ATP)的检测。具体内容如下:1.概述了近几年核酸信号放大方法和G-四链体在生物传感器中的发展应用。2.本章构建了一种氧化石墨烯(GO)作为荧光偏振放大因子结合均相外切酶辅助信号放大方法用于HIV DNA的检测。T7外切酶可以从钝化或嵌壁式的双链DNA的5’端逐个消化水解核苷酸,然而T7外切酶对5’突出端的单链DNA和双链DNA没有活性。发夹探针P1的5’末端突出了 5个碱基,没有靶标时,探针P1不被T7外切酶水解。有靶标时,靶标打开探针P1,加入T7外切酶时,经过酶水解作用产生单链DNA,单链DNA吸附在GO表面,因而体系的荧光偏振值增强。该方法利用T7外切酶辅助靶标循环放大反应和GO纳米材料强大的增强荧光偏振的优势,获得方法的线性范围为50～2000 pmol·L-1,检测限为38.6pmol·L-1(S/N = 3),线性相关系数R2=0.991。本方法能够区分单碱基错配序列,与其他方法相比,本方法简单、灵敏、可用于均相溶液中,不需要复杂的操作步骤。同时该荧光偏振传感平台还可以应用到其他靶标物质的检测。3.本章提出了一种均相、酶辅助二次循环放大方法并结合GO作为荧光偏振增强因子用于检测HIV DNA。本实验中,在没有靶标时,发夹探针P1和FAM标记的发夹探针P2少量吸附在GO表面上,体系的荧光偏振值(FP)小;在靶标存在条件时,发夹探针P1和靶标杂交互补,形成部分双链DNA,一端是5’钝化端,另一端是5’突出端,然后双链DNA在T7外切酶水解条件下,产生X-DNA,靶标可以重新与发夹探针P1杂交循环,进而产生大量的X-DNA,该过程为循环1;产生的X-DNA与发夹探针P2杂交,打开发夹探针P2形成部分双链结构,在T7外切酶水解条件下,产生5’端标记FAM的ssDNA和X-DNA,而X-DNA又可以与发夹探针P2重新循环杂交,构成循环2,由此产生大量的标记有染料的ssDNA,这些ssDNA吸附在GO表面上,导致体系的荧光偏振值(FP)急剧增大。本方法具有以下几个优点:首先,利用T7外切酶辅助二次信号放大,同时也利用GO作为强有力的增强荧光偏振的纳米材料,这两者使得本方法具有较低的检测限,检测限为9.12pmol.L-1(S/N = 3),和较宽的线性范围(0.05～8 nmol·L/-1),线性相关系数为R2= 0.987;其次,该方法具有较高的选择性,可以扩展到其他功能化的探针,为其他核酸和小分子检测提供了新的发展平台;最后,该方法在均相中操作,不需要分离及其他复杂的操作步骤,稳定性良好,而且该方法可以应用到实际样品中,在临床诊断方面有一定的应用前景。4.本章建立了一种基于外切酶Ⅲ和T4 DNA连接酶辅助的无标记荧光生物传感器,用于检测腺苷三磷酸(ATP)。在没有靶标ATP分子存在下,T4DNA连接酶不能够将G1 DNA链和5’末端磷酸化的G2 DNA链连接起来,当加入外切酶Ⅲ时,G1 DNA链和P DNA链被外切酶Ⅲ水解消化,最后剩下G2 DNA链,因为G2 DNA链只含有G-四链体序列的部分碱基序列,因此无法形成G-四链体结构,加入NMM染料,产生荧光很弱,因此背景荧光值很小;当存在靶标ATP分子时,T4DNA连接酶催化G1DNA链的3’-OH末端和G2 DNA链的5’-PO4末端形成磷酸二酯键,得到一条新的长链DNA(即G1 DNA+ G2 DNA),加入外切酶Ⅲ,此时P-DNA链被外切酶Ⅲ水解消化,剩余G1DNA + G2DNA链,加入G-四链体形成缓冲液和NMM染料,产生很强的荧光信号值。通过加靶前后体系的荧光值变化可对靶标ATP分子进行定量检测。在ATP浓度在500 pmol·L-1～200 nmol·L-1范围内,体系的荧光强度变化值与ATP的浓度呈线性关系,线性相关系数R2=0.996,检测限为0.2 nmol·L-1(S/N = 3)。该方法利用NMM染料插入G-四链体后产生的强荧光作为检测信号,使得该方法无需标记染料,方法简单。且本方法具有良好的选择性和抗干扰性,及较宽的线性范围及较好的灵敏度,有望用于实际应用中。