黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）是一类由真菌寄生曲霉菌、黄曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物,广泛存在食品和饲料中。其中,以黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁,AFB₁）的肝毒性、基因毒性和免疫毒性最强。卵黄免疫球蛋白（Egg Yolk Immunoglobulin,IgY）又称卵黄抗体,存在于经特定抗原免疫禽类的蛋黄中,与哺乳动物血清IgG具有相同特性,能与抗原特异性识别结合。已应用于婴幼儿食品和畜禽饲料中,抵抗病毒和细菌性疾病的侵害。另对IgY研究发现,IgY还可以有效识别大分子蛋白毒素如蛇毒、细菌外毒素等,起到降低毒素毒性的作用。目前,卵黄抗体对小分子毒素的降毒效应缺少基础研究。本研究首次探讨IgY对小分子毒素的降毒效应和其机制。以小分子真菌毒素AFB₁为研究对象,小分子真菌毒素ZEN设为对照,合成半抗原后偶联成人工全抗原,免疫蛋鸡制备得到高纯度和特异性IgY。建立细胞染毒模型探讨抗AFB₁-IgY对AFB₁诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用;以及在其它细胞系中对AFB₁诱导细胞毒性的抑制作用;同时建立体内AFB₁诱导肝损伤模型和代谢实验,探讨抗AFB₁-IgY降低AFB₁诱发肝基因毒性和氧化损伤效应机制。本论文的主要研究成果及结论总结如下:⑴制备出高纯度和特异性抗AFB₁-IgY采用加成法AFB₁与乙醇酸（GA）合成半抗原AFB₁-GA,ZEN与羧甲氧基胺半盐酸盐（CMO）反应合成半抗原ZEN-CMO,再通过活泼酯法将AFB₁-GA和ZEN-CMO半抗原与载体蛋白（BSA和OVA）偶联制备AFB₁-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA人工抗原,免疫蛋鸡,收集鸡蛋。采用酸性条件下水稀释法和微孔过滤提取蛋黄水溶液,结合盐析法和大分子沉淀法纯化IgY,获得高纯度IgY,纯度为⁹4%。实验发现抗原不同,蛋黄中抗体活性随免疫时间的变化情况也不尽相同,用AFB₁-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA免疫蛋鸡,均能产生IgY,但产生的活性和时间不同,AFB₁-GA-BSA免疫蛋鸡产生IgY的抑制率较高,获得高活性IgY的时间相对较短。本实验中制备的抗AFB₁-IgY对抗原AFB₁的灵敏度较高,最低检测限LOD为0.06ng/mL,IC₅₀为2.4ng/mL,检测线性范围为0.13³2.8ng/mL,对AFB₂、交叉反应率均低于5%,而AFG₁和AFG₂交叉反应率均低于0.1%,反应出抗AFB₁-IgY对AFB₁有很好的特异性、识别和结合能力。制备的抗ZEN-IgY对抗原ZEN的灵敏度表现相对较低,最低检测限LOD为9.27ng/mL,IC₅₀为83.76ng/mL,检测线性范围为13.78⁵08.85ng/mL,对玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的交叉反应分别小于:85%,20%和20%;而对AFB₁和赭曲霉毒素的交叉反应小于2%,反应出ZEN-IgY对ZEN有一定的识别和结合能力,但特异性较差。⑵体外抗AFB₁-IgY对AFB₁诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用建立人正常肝细胞L-02体外染毒模型,研究抗AFB₁-IgY对AFB₁诱导细胞毒,功能紊乱(活性氧化产物和线粒体膜电位和基因毒性的抑制作用。结果显示分别添加0.125μM、0.25μM和0.5μM抗AFB₁-IgY与100μM AFB₁于培养基中与L-02细胞孵育48h后,细胞的存活率明显升高、凋亡数量下降、周期阻滞和线粒体膜电位变化得到缓解、活性氧化产物降低、DNA损伤改善。并且随着抗AFB₁-IgY浓度的增加,相对AFB₁处理组抑制凋亡蛋白BCL2和survivin的表达水平随之增加,而促凋亡蛋白caspase-3和BAX的表达水平随之降低,实验结果显示抗AFB₁-IgY本身对细胞凋亡蛋白并没有调节作用,细胞的抗氧化蛋白CAT和SOD1的表达水平亦没有随着抗AFB₁-IgY的增加活性增加。AFB₁进入细胞终产物AFB₁-DNA的浓度检测发现随着抗AFB₁-IgY的添加,形成的AFB₁-DNA加合物浓度逐步降低。综合以上实验结果:随着抗AFB₁-IgY的添加,抗AFB₁-IgY与AFB₁的特异性识别结合后形成蛋白大分子复合物,此复合物不能被细胞所吸收,AFB₁进入细胞量减少,随之降低AFB₁诱导的细胞毒性、功能紊乱和基因毒性。⑶其它细胞系中抗AFB₁-IgY对AFB₁诱导细胞毒性的抑制作用基于AFB₁主要靶器官肝脏、肠道和生殖系统,选取人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HTC-8和人孕早期滋养层细胞Swan 71作为研究对象,建立三种细胞AFB₁的染毒模型,进一步补充、丰富抗AFB₁-IgY对AFB₁诱导细胞毒性的抑制作用数据。结果显示抗AFB₁-IgY能降低AFB₁对三种细胞存活率的抑制,及AFB₁诱导HTC-8细胞的凋亡,存在明显的剂量效应关系;通过transwell实验发现抗AFB₁-IgY能降低AFB₁抑制Swan 71细胞的侵袭和迁移功能。以上结果表明,在其它细胞系中抗AFB₁-IgY同样具备对AFB₁诱导细胞毒性抑制能力,推测机体同时摄入抗AFB₁-IgY和AFB₁后,能降低AFB₁对机体的肝毒性、生殖毒性及肠道损伤。⑷抗AFB₁-IgY对AFB₁诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤的预防作用为探讨抗AFB₁-IgY对AFB₁诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤抑制作用及机制。通过体外实验确定抗AFB₁-IgY和AFB₁体外结合比例,建立AFB₁诱发大鼠肝损伤模型和AFB₁代谢实验。实验结果显示抗AFB₁-IgY是一种有效的营养保护剂,可以抑制AFB₁诱发早期肝脏损伤生化标志物变化,但IgY并不是通过增加抗凋亡蛋白表达和抗氧化酶活性来实现对肝的保护。进一步AFB₁在血液、尿液、肝脏和粪便的代谢产物研究发现中高剂量抗AFB₁-IgY与AFB₁共同处理大鼠后,AFB₁-DNA加合物分别减少了43.3%和52.9%;AFB₁-alb分别减少了10.5%和21.1%;AFB₁-N⁷-gua分别减少了19.6%和34.4%,粪便中AFB₁增加了约2倍,AFB₁-DNA、AFB₁-alb和FB₁-N⁷-gua是AFB₁诱导机体基因毒性的标志产物,结果证实抗AFB₁-IgY是通过抑制AFB₁的吸收起到基因毒性预防作用。实验结果证实抗AFB₁-IgY能够识别并结合小分子毒素AFB₁,形成非共价复合物,减少机体对AFB₁吸收,降低小分子毒素AFB₁对肝脏组织的基因毒性和氧化损伤。本研究首次为口服IgY抑制动物体内小分子毒素的摄取提供了实验依据。综上所述,抗AFB₁-IgY对AFB₁具有潜在的降毒作用。在体外实验中抗AFB₁-IgY通过与AFB₁的结合,减少了AFB₁进入细胞所诱发的细胞毒性、细胞功能紊乱和基因毒性。在体内实验中抗AFB₁-IgY通过与AFB₁形成的非共价复合物,减少胃肠道对AFB₁的吸收,降低AFB₁诱发肝基因毒性和氧化损伤。本研究增加了抗体新的应用途径,为脱除小分子毒素提供了一种新的思路。