研究背景任何生命体系中都存在负反馈调节。在免疫系统中,目前普遍认为,调节性T细胞(Treg cells)在下调辅助性T细胞的免疫活动,维持多种生理状态下的免疫平衡中发挥重要作用。调节性T细胞可有力地保持免疫系统对生理性或病理性自身抗原的耐受作用,控制自身免疫反应的强度及范围,防止、降低机体对病原或过敏原免疫应答的失控和反应过度；协助调节机体内必需的微生物菌丛的稳态；同时,调节性T细胞还参与了肿瘤细胞的免疫逃逸机制,促进肿瘤细胞脱离免疫系统的监控,从而加快了肿瘤组织的生长与扩散。目前在实验小鼠中,基于细胞表面抗原,已经被分离、鉴定出来的最重要的一类调节性T细胞,是CD4+CD25+T细胞亚群。机体内自然生成的CD4+CD25+调节性T细胞,在胸腺中发育、成熟为具有特定功能的T细胞群,并表达叉状头/翼状螺旋转录因子(forhead-winged helix transcription factor, Foxp3).Foxp3在调节性T细胞的发生发展及免疫调节功能中有关键性的作用。Foxp3+调节性T细胞也通过αβT细胞受体识别抗原；在组成上,这种T细胞受体具有与普通T细胞相似但又有其独特性的TCR谱型。调节性T细胞的作用机制具有多态性,目前已研究发现多种作用模式及多种媒介因子参与调节性T细胞的免疫调节功能,包括：通过抑制性细胞因子,通过细胞毒作用,通过干扰细胞代谢及通过介导树突状细胞等抗原递呈细胞的成熟与功能等等。调节性T细胞是免疫系统的重要成分,尤其在自身免疫性疾病中发挥重要作用,掌握调节性T细胞的作用机制具有相当重要的意义。目前关于调节性T细胞的研究多建立在炎症及肿瘤发生发展的环境中,比如消化系统中的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)及炎症相关性癌(inflammation-associated cancers)。有学者提出自身免疫性疾病的卫生假说(hygiene hypothesis),其中包括消化道的感染导致具有免疫调节功能的T细胞数量或功能的变化,是炎症性肠病等慢性炎症疾病及炎症相关结肠癌的发病机制之一；也有研究者提出,调节性T细胞同时也可通过IL-10等抑制性细胞因子的作用下调消化道炎症反应,维持消化道免疫系统稳态,而降低消化道肿瘤的风险。本论文着重探讨CD24分子对调节性T细胞免疫抑制功能的影响。CD24是一种表达于人及小鼠多种细胞表面的低分子糖蛋白,特征之一是其细胞表面锚定的磷脂酰肌醇高度糖基化,不同组织分离的CD24分子具有不同的分子重量,提示其不同的组织环境下独特的细胞功能。由于其热稳定性,鼠CD24又被称热稳定蛋白。CD24表达于多种类型的细胞表面,主要于造血系统,包括发育中的T细胞和大部分B细胞,抗原递呈细胞等；CD24还表达于非造血系统,包括神经系统,上皮细胞和多种类型的肿瘤细胞等等。多数情况下,CD24以较高的水平表达于祖细胞或代谢旺盛的细胞,较低水平地表达于分化成熟细胞。CD24分子在大部分细胞类型上的功能还不甚清楚。目前已有文献报道CD24在免疫系统中发挥多种不同的介导作用。有作者报道,尽管T细胞在发育、成熟的过程中下调CD24的表达量,但其在TCR-CD3复合体介导的抗原抗体反应中可快速上调CD24的表达。还有研究者发现表达于抗原递呈细胞表面的CD24通过参与共刺激调节通路,介导CD4、CD8T细胞免疫反应；还有文章提出表达于T细胞的CD24是T细胞稳态增殖的必要条件。最先发表CD24与自身免疫性疾病发生发展有关联的报道是,CD24缺陷的小鼠对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)的诱导、发生具有高度抵抗性。进一步研究发现CD24的基因多态性与多种自身免疫性疾病的发生、进展具有相关性,包括多发性硬化、风湿性关节炎及系统性红斑狼疮。CD24调节自身免疫性疾病的机制仍待研究。此外,有关CD24的另一个研究热点集中在肿瘤领域。CD24高表达于多种类型的肿瘤组织,包括小细胞性肺癌,肝细胞性肝癌,乳腺癌等。CD24是一种重要的肿瘤诊断及预后标志物。有学者发现,细胞表面及细胞内CD24的表达与乳腺癌的不良预后、组织病理学分级、肿瘤大小和淋巴转移活性等有重要相关性。但是,仍需要大量的研究来深入探讨CD24在肿瘤发病机理中的作用。目前,关于CD24分子在免疫系统中的作用还存在许多争议,CD24对T细胞的作用还不清楚。此外,关于CD24与调节性T细胞功能的研究报道甚少。基于CD24分子与T细胞功能的相关性,本论文利用CD24缺陷型转基因小鼠,从外周分离出CD4+CD25+细胞作为我们研究中的调节性T细胞,试图通过多个水平,探讨CD24对CD4+CD25+调节性T细胞免疫抑制功能的影响。在小鼠体内实验中,我们借助EAE小鼠模型,研究CD24缺陷型调节性T细胞对自身免疫反应的影响。希望通过多层面探讨CD24分子对调节性T细胞免疫抑制功能的影响,为自身免疫性疾病的诊断、治疗提供新的思路。实验方法1.定量分析野生型与CD24缺陷型小鼠调节性T细胞中Foxp3的表达差异及其T细胞受体型谱。1.1实验分组：根据不同背景、不同基因型、不同组织进行实验分组为野生型(Wild type, WT)脾细胞组、CD24缺陷型(CD24knock out, CD24-/-)脾细胞组、WT胸腺细胞组、CD24-/-胸腺细胞组。同时于BALB/c及C57BL6小鼠中进行,分别比较。1.2用血细胞计数板计算脾、胸腺器官细胞总数。1.3应用流式细胞术,进行细胞表面(抗CD4抗体)及细胞内(抗Foxp3抗体)荧光染色,结果以CD4+Foxp3+细胞百分比及CD4+Foxp3+细胞总数表示,定量比较两种小鼠的脾组织、胸腺组织中Foxp3表达量的差异。1.4应用流式细胞术,进行细胞表面荧光染色,定量比较两种小鼠的脾组织、胸腺组织中CD4+和CD8+T细胞的T细胞受体型谱。1.5应用流式细胞术,进行细胞表面(抗CD4、抗CD24抗体)及细胞内(抗Foxp3抗体)荧光染色,检测CD24在CD4+Foxp3+细胞表面的表达量。1.6应用流式细胞术,进行细胞表面荧光染色,定量比较两种小鼠的脾组织、胸腺组织中CD4+Foxp3+细胞的T细胞受体型谱(抗TCR vβ2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14抗体)。2.观察比较野生型与CD24缺陷型小鼠的CD4+CD25+调节性T细胞的体外免疫调节功能的差异。2.1实验分组：WT.Treg组和CD24-/-.Treg组,同时于BALB/c及C57BL6小鼠中进行,分别比较。2.2FACS法或MACS法分离CD4+CD25+调节性T细胞制备WT或CD24-/-小鼠的脾和淋巴组织的单细胞悬液,根据试剂公司操作指南,应用荧光激活细胞分选法(Fluorescence-activated cell sorting, FACS)或免疫磁珠细胞分选法(MACS microbeads)分离出CD4+CD25+T细胞作为本实验的调节性T细胞(regulatory T cell, Treg), CD4+CD25-细胞作为普通T细胞(conventional T cell, Tconv)。2.33H胸腺嘧啶核苷渗入法比较WT和CD24-/-CD4+CD25+Treg细胞的体内免疫抑制功能。3H胸腺嘧啶核苷渗入法([3H]-TdR)的淋巴细胞增殖抑制(Suppression assay)试验,以每孔约50000个CD4+CD25-Tconv细胞接种在96孔板,按不同Effector cell:Target cell比例,即Tconv:Treg比例(1：1,2：1,4：1,8：1,16：1及空白对照)接种CD4+CD25+Treg细胞,以2000Rad照射的Rag-1或Rag-2缺陷脾细胞作抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC),培养约60h；加入[3H]-TdR,0.1μ Ci/well继续培养8-16小时,测定摄入3H值CPM,比较不同Treg细胞对Tconv细胞体外增殖的影响。2.4荧光定量RT-PCR测定细胞因子水：IL-2、IL-10、TGF-β、P35、EBI-3。分离出调节性T细胞后,按照QIAGEN RNeasy Mini Kit步骤要求提取细胞中总RNA。将提取的总RNA应用SuperScript(?)Ⅲ First-Strand Synthesis System进行逆转录,获得cDNA。按照QuantiTect SYBR Green PCR kit荧光定量试剂盒步骤要求,配置反应体系。每个细胞每种启动子设置3个复孔。荧光定量PCR检测仪进行目的片段扩增和荧光信号检测,反应条件为：第一步95℃15s,第二步56℃,30s,72℃30s,共40个循环；反应过程中自动收集荧光。2.5酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养基中细胞因子水平：IL-2、IFN-γ、 IL-10。3.观察比较野生型和CD24缺陷型调节性T细胞在EAE小鼠模型体内的免疫调节功能。3.1实验小鼠分组：WT.Treg注射组、CD24-/-.Treg注射组、空白对照组或阳性对照组(只注射CD4+CD25-T细胞)。3.2依上述MACS法分离CD4+CD25+调节性T细胞3.3MOG蛋白诱导C57BL6小鼠建立EAE小鼠模型1)MOG诱导当天为第0天：于C57BL6小鼠两侧臀部皮下注射100μLMOG混合乳剂[200μg MOG35-55(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,髓鞘少突胶质细胞糖蛋白)]+CFA(含400μg/ml结核分枝杆菌),随后马上尾静脉注射200μL PBS(含150ng百日咳毒素)；同时尾静脉注射1x106CD24-/-Tconv细胞和0.5x106WT或CD24-/-Treg细胞。2)第2天：尾静脉注射200μL毒素。3)每日观察实验小鼠,按照5分法进行EAE临床评分：0,无明显异常；1分,鼠尾萎软或后肢无力(非同时出现鼠尾萎软和后肢无力)；2分,鼠尾完全萎软伴后肢无力或伴后肢部分麻痹；3分,后肢完全麻痹；4分,后肢完全麻痹伴前肢无力或麻痹；5分,四肢瘫痪或垂死。4统计学处理在EAE模型中,仅作结果的描述,不作统计学分析。其余数据以mean±SD(x±s)表示,采用t检验(student’s t test),包括配对样本t检验(paired t test)、独立样本t检验(independent sample t test)和单样本t检验(one sample t test:当某一组样本量不足,结果只有一个常数时)。当P<0.05认定差异具有统计学显著性。实验结果1CD24分子对小鼠淋巴器官发育的影响分析1.1CD24分子对小鼠胸腺发育的影响分析Balb/c.CD24-/-小鼠的胸腺组织体积较WT组小；分成<10周、>10周两组进行胸腺总细胞计数,Balb/c.CD24-/-小鼠的胸腺细胞总数均比WT小鼠的少,分别为t=2.529、P=0.045和t=4.642、P=0.002。在C57BL6中,WT和CD24-/-两种小鼠的胸腺细胞总数没有显著性差异,分别为t=0.061、P=0.954和t=1.606、P=0.169。1.2CD24分子对胸腺细胞克隆选择的影响进行TCR vβ荧光染色,整体上,CD24-/-小鼠的胸腺细胞及脾淋巴细胞的T细胞受体谱型与WT小鼠相当,只有个别亚群体现出数量上的差别。比如C57BL6.CD24-/-小鼠胸腺CD4+细胞中TCRvβ11、vβ12细胞比例下降(分别为t=3.183、P=0.010; t=4.518、P=0.002),提示在WT小鼠中,CD24可能参与TCR vβ11、vβ12T细胞的克隆去除的逃逸。2Foxp3在CD24-/-小鼠的表达及其T细胞受体谱型分析2.1Foxp3细胞内染色及流式细胞术分析Balb/c.CD24-/-小鼠脾细胞的Foxp3表达百分比低于WT小鼠,t=4.932、 P<0.001; CD24-/-的Foxp3+细胞数量也相对较低,t=5.144、P<0.001。在胸腺组织中,Balb/c.CD24-/-小鼠的Foxp3表达比与WT小鼠相当,P>0.05；但CD24-/-Foxp3+细胞数量低于WT,t=2.574、P=0.022。而在C57BL6种系小鼠中,CD24-/-脾、胸腺细胞中的Foxp3表达百分比及Foxp3+细胞总量均高于WT小鼠,但只有胸腺细胞中的Foxp3+细胞总量的差异具有统计学意义,t=3.394、P=0.009。2.2Foxp3+调节性T细胞的TCR谱型分析与总T细胞TCR谱型结果近似,CD24-/-小鼠的Foxp3+Treg细胞的TCR Vβ整体上与WT Treg细胞无明显差异,个别亚群如Balb/c小鼠中的vβ4、vβ7, C57BL6小鼠中的vβ3、vβ12有数量上的变化。3CD24在Treg细胞表面的表达情况以CD24-／-细胞及抗IgG2b Isotype抗体作参照,CD24在胸腺、脾、淋巴组织中的Treg细胞表面亦有一定水平的表达。4CD24对Treg细胞体外免疫抑制功能的影响4.1淋巴细胞增殖抑制试验在Balb/c小鼠中,CD24-/-Treg细胞比WT.Treg细胞具有更强的增殖抑制功能,这种差异主要发生在CD24-/-.Tconv作Effector cell且高浓度Treg (Tconv: Treg为1：1)的环境中：WT.Treg和CD24-/-.Treg对WT.Tconv的增殖抑制率分别是31.134±5.67%和45.479±3.955%,t=3.594,P=0.023；对CD24-/-.Tconv的抑制率分别是33.122+4.931%和57.345+2.595%,t=4.931,P=0.002。在C57BL种系小鼠中,WT.Treg和CD24-/-.Treg对WT.Tconv的抑制率没有统计学差异(P>0.05)；而在CD24-/-.Tconv作Effector cell的培养体系中,其结果与Balb/c小鼠相吻合,在高浓度Treg细胞条件下,WT.Treg和CD24-/-.Treg的增殖抑制率分别是6.873±5.439%和43.156±6.629%,t=4.981、P=0.016。使用CD24-/-.Tconv及CD24-/-APC,在细胞培养的最初加入不同浓度(10μg/ml、5μg/ml)的抗CD24封闭抗体(a-CD24), WT.Treg的抑制率增高,且抑制率提高具有抗体浓度依赖性；但是差异不具有统计学意义(P>0.05)。4.2CD24对细胞因子表达的影响在荧光定量rt-PCR中,以WT.Tconv细胞的mRNA水平为参照,CD24-/-.Treg细胞较WT.Treg表达更高水平的IL-10、TGF-p和EBI-3mRNA,分别为t=10.457、P<0.001; t=16.332、P<0.001和t=5.846、P=0.004。高表达的抑制性细胞因子可能是CD24-/-.Treg细胞表现出更强的增殖抑制功能的作用机制之一。在各细胞亚群培养上清中,WT和CD24-/-的Tconv、Treg的IL-2、IFN-γ分泌量无明显差异(P>0.05)。CD24-/-Treg的上清中检测到更高浓度的IL-10, t=5.416、P=0.006,提示CD24-/-.Treg细胞可能比WT.Treg细胞分泌更多的IL-10。在Tconv和Treg细胞共培养体系中,CD24-/-.Treg细胞的培养上清中检测到的IL-2、IFN-γ浓度低于WT.Treg细胞的上清,在CD24-/-.Tconv的培养系统中,分别是t=101.717、P<0.001和t=5.800、P=0.004,差异具有统计学意义。共培养体系中的IL-10产生量无显著差异,P>0.05。5CD24对Treg细胞体内免疫抑制功能的影响静脉注射多克隆的CD24-/-.Tconv细胞5x106/mouse,及0.37x106/mouse的Treg细胞,可观察到注射WT.Treg细胞的小鼠发病较早,且平均分较CD24-/-.Treg细胞注射组高。在另一组实验中,MOG诱导EAE的同时,静脉注射单克隆的2D2.CD24-/-.Tconv细胞1x106/mouse,及0.50x106/mouse的Treg细胞(成分不变),两组小鼠全部发病,WT.Treg细胞的小鼠发病较早,临床平均分较CD24-/-.Treg细胞注射组高。提示在小鼠体内CD24-/-.Treg细胞比WT.Treg细胞可能发挥更高的免疫抑制作用,CD24-/-.Treg细胞对EAE的保护作用更强。讨论CD24分子在胸腺细胞的发育过程起到一定的作用；整体上,CD24-/-T细胞的TCR谱型与WT相当,仅有个别亚群有数量上的差别。不同种系小鼠中CD24对Foxp3的数量的影响略有差别；体外实验中,CD24-/-调节性T细胞具有更强的增殖抑制功能,但是这种增强可被Tconv上CD24的表达部分抵消。关于细胞因子的研究中,CD24-/-.Treg细胞可通过高分泌IL-10、TGF-β、IL-35等抑制性细胞因子发挥更强的免疫抑制功能；而在与Tconv的接触中,可能通过多种作用,影响了与增殖和功能相关的IL-2、IFN-γ等细胞因子,进而抑制Tconv细胞的作用。EAE模型的体内实验中,对多克隆Tconv或2D2单克隆Tconv,均观察到CD24-/-.Treg细胞比WT.Treg细胞发挥更高的免疫抑制作用,对EAE疾病的保护作用更强,主要表现在延缓EAE的发病,减轻EAE的发病程度,但不足以防治EAE。CD24分子的研究可为基于调节性T细胞的自身免疫性疾病的防治中提供新的思路。