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目的肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，全球每年新发肝癌病例约56万，我国占1/2以上。手术切除目前仍然是肝癌的主要治疗手段，但是接受根治性手术的肝癌患者5年生存率仅为30%～40%，因此早期诊断和治疗对肝癌病人的预后起着决定性的作用。目前HCC的常规筛查和诊断方法包括体格检查、影像学检查及血清甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP）检测。AFP虽为诊断HCC的首选指标，但其敏感性只有50％～70％，特别是早期HCC，AFP敏感性仅40%左右。故急需寻找一种敏感性更高、特异性更强的新肿瘤标志物，建立高效、便捷的检测方法，提高HCC的早期诊断率。最近的研究发现，血清高尔基体蛋白73（Golgiprotein73，GP73）在诊断HCC中其敏感性和特异性均优于AFP，GP73可能是肝癌诊断的一个新的标志物。因此，本试验拟制备抗GP73单克隆抗体（mAb），初步鉴定其生物学功能，并将所制备的单克隆抗体用于建立定量检测GP73的双抗体夹心ELISA方法，应用此方法检测人血清中GP73含量。方法1.利用RT-PCR技术扩增人gp73基因；构建gp73原核表达载体pComb3XSS-gp73，导入E.coli. Top10F′菌株，IPTG诱导表达后进行Western blot鉴定，以His TrapFF亲和层析柱纯化His-GP73融合蛋白。2.以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合，依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆化，以获得稳定分泌a-抗GP73mAb杂交瘤单克隆细胞株。3.以间接ELISA法检测抗体效价；以Sigma公司提供的mAb亚类检测试剂盒进行抗体亚类鉴定；以Western blot鉴定抗体特异性；利用免疫共沉淀法初步检测在肝癌患者血清中GP73表达水平。4.以a-GP73mAb3D5A10作为包被抗体，HRP标记的a-GP73mAb5E2G6作为检测抗体，通过方阵滴定法确定最适工作浓度及反应条件；以纯化的GP73抗原为标准品建立标准曲线。5.建立双抗体夹心ELISA法测定正常人、慢性肝炎患者、肝癌患者血清中GP73的含量。结果1.成功构建了表达质粒pComb3XSS-gp73。2.成功诱导表达并纯化了His-GP73融合蛋白，浓度为2.5mg/mL；纯度达80%以上。3.获得了5株稳定分泌抗人GP73mAb杂交瘤细胞株，分别命名为3D5A10、8C4G5、5E2G6、7C8F4和7H3F5；其免疫球蛋白亚类重链分别为IgG1、IgG1、IgG2a、IgG2a、IgG3，轻链均为κ型，每株抗体效价均达1:160,000以上。利用Westernblot检测证明a-GP73mAb能够识别细胞裂解液中的天然GP73蛋白。免疫共沉淀证实其能与肝癌患者血清中GP73蛋白特异性结合，且GP73水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。4.建立了一种可用于定量检测GP73的双抗体夹心ELISA方法，最低检测限为1.56ng/mL。5.定量测定了66例正常人、65例慢性肝炎和33例肝癌患者血清中GP73含量。结果显示肝癌组和肝炎组均较正常对照组GP73含量明显升高（P<0.05）；肝癌组与慢性肝炎组比较也存在显著性差异（P<0.05）。结论本研究成功构建了pComb3XSS-gp73表达质粒，并表达了His-GP73融合蛋白，以该融合蛋白为免疫原，成功制备出了抗人GP73mAb，将该单抗应用于血清学的初步研究，建立双抗体夹心ELISA法，利用建立的免疫检测方法测定了正常人、慢性肝炎和肝癌血清样本中GP73含量，结果表明GP73水平在肝癌患者和慢性肝炎患者血清中较正常人异常升高，而在肝癌组又显著高于慢性肝炎组和正常组，提示GP73分子在肝癌早期具有预警价值，有望成为肝癌早期诊断标志物。