甲醇营养型毕赤酵母(Methylotrophic Pichia pastoris)是近年来应用广泛、发展迅速的一种外源蛋白表达系统。实现目标外源蛋白(猪α干扰素,pIFN-α;人血清白蛋白-人白介素-2融合蛋白,IL-2-HSA)的高效表达离不开有效的过程控制策略。然而,发酵过程的控制和优化一般建立在非构造式动力学模型的基础上,难以适应发酵过程的时变特征,严重制约了过程控制和最优化系统的有效性和通用能力。为进一步改善毕赤酵母培养过程的控制性能,首先要深入理解毕赤酵母细胞在不同阶段的代谢特征和生理状态。然后结合智能模式识别控制和宏观的代谢调控等方法,针对毕赤酵母发酵过程的不同阶段,建立有效、通用的在线控制和故障诊断方法。基于以上的学术思想,本论文主要开展了以下研究:(1)在5 L发酵罐中研究了不同的甘油流加策略对毕赤酵母细胞生长和蛋白(pIFN-α)表达的影响。传统的DO-Stat流加策略导致细胞的比生长速率很低,在后续的诱导阶段细胞干重只有90 g/L。采用基于DO/pH在线测量和人工神经网络模式识别模型的控制系统(Artificial Neural Network Pattern Recognition based Control, ANNPR-Ctrl),可以把细胞浓度提高到120 g-DCW/L,pIFN-α的浓度也从采用DO-Stat流加策略时的0.43 g/L提高到了0.95 g/L。但此方法在甘油流加阶段的最后10 h,细胞的比生长速率由0.15~0.18 h-1降至0.03~0.08 h-1,导致pIFN-α产量的不稳定。该问题通过改进型的ANNPR-Ctrl系统(Imp-ANNPR-Ctrl)得以解决。新的流加策略使细胞的比生长速率维持在0.11 h?1以上,相应的pIFN-α的浓度达到了1.43 g/L的水平,是采用标准的ANNPR-Ctrl控制系统时pIFN-α浓度的1.5倍。研究结果表明,提高培养期细胞的比生长速率有利于诱导期外源蛋白的表达。通过Imp-ANNPR-Ctrl流加策略,细胞浓度和比生长速率都得到了提高,pIFN-α的生产性能也相应改善。(2)前期研究对比了不同甲醇浓度水平(5 g/L, 10 g/L和20 g/L)对pIFN-α表达的影响。结果表明甲醇浓度10 g/L条件下,pIFN-α的表达水平最高为1.25 g/L。而在此条件下,诱导初期OUR/DO的变化模式显示细胞有6 h左右的适应期,说明这一阶段甲醇浓度过高。为了缩短细胞适应期,提高蛋白表达水平,我们提出了两阶段甲醇浓度控制策略。即甲醇浓度在诱导前20 h从0 g/L线性增加到10 g/L,在20 h后维持在10 g/L的水平。在此条件下,pIFN-α的最高浓度达到了1.81 g/L。(3)在毕赤酵母表达外源蛋白过程中,诱导期甲醇浓度是最重要的控制参数,如何准确有效的把甲醇浓度控制在合适的范围内直接决定了蛋白表达量的高低。在研究氧气消耗速率(OUR)和pIFN-α表达水平以及甲醇浓度的相互关系的基础上,我们发现,正常发酵时,诱导期OUR稳定在200~250 mmol/L/h的水平。当甲醇浓度突然升高时(>20 g/L),OUR迅速下降,出现转折点。通过在线监控OUR的变化模式,我们建立了一种简单的在线故障诊断方法。该方法能够在线及时准确地识别甲醇浓度过高的问题,pIFN-α表达的稳定性得到进一步增强。(4)单一过程参数(OUR)进行故障诊断不具有通用性。通过选取多个在线参数(OUR,CER,搅拌转速,甲醇流加量,氨水流加量等),我们提出了基于自联想人工神经网络的毕赤酵母表达IL-2-HSA过程的甲醇诱导期两阶段故障诊断方法。该方法能够在线及时准确地识别甲醇电极出现的各种故障和pH值的漂移。当系统提示出现故障时,离线分析,并对比最优化的pH值和甲醇浓度变化曲线,确定故障类型,采取相应措施。当出现甲醇浓度过高的故障时,通过以2 g/L/h的速率限制性添加甘油可以有效提高菌体的呼吸活性,促进菌体生长,缓解甲醇过量积累对细胞的毒害作用。(5)在前期5 L发酵罐研究的基础上,我们开展了10 L发酵罐规模的放大研究。结果表明,采用相同的甘油流加和甲醇诱导控制策略,pIFN-α在10 L发酵罐中的表达水平明显低于5 L罐。其主要原因是蛋白表达的时间缩短,降解严重,细胞代谢活性较低。为解决上述问题,我们采用了低温(20℃)诱导策略。在此条件下,毕赤酵母的最大耐甲醇能力达到约40 g/L,有效地解决了因甲醇浓度变化造成的系统不稳定问题。此外,通过甲醇代谢和能量代谢分析计算表明,在20℃下,更多的碳流用于pIFN-α蛋白的合成;ATP再生效率提高了49~66%;pIFN-α最高浓度水平从0.29 g/L提高到1.1 g/L (比活性1.4×10~6 IU/mg)。10 L发酵罐中pIFN-α表达水平有了明显提高,基本达到5 L罐的水平。(6)降低诱导温度能够有效提高毕赤酵母发酵生产pIFN-α的性能。但低温条件下,大量冷却水的消耗和氧气消耗速率的提高导致发酵成本明显上升。在10 L发酵罐和不同诱导策略(30℃/20℃甲醇单独诱导和30℃甲醇/山梨醇混合流加)条件下,我们开展了过程参数和代谢酶学分析以及能量代谢过程解析。结果表明:当采用30℃甲醇/山梨醇混合流加时,pIFN-α合成的主要供能途径由甲醇诱导时的甲醛异化产能途径转向混合流加时的TCA循环。混合流加条件下,甲醛异化代谢途径被弱化,有毒代谢中间产物甲醛的积累得到有效缓解;理论耗氧速率大幅下降,整个诱导阶段溶氧浓度处在适中的水平;能量和甲醇的利用效率显著提高,更多的甲醇可以直接用于细胞和蛋白的合成。此时,pIFN-α浓度达到2.1 g/L,比活性8.6×10~6 IU/mg。另外,甲醇/山梨醇混合流加可以在30℃常温和使用空气供氧的条件下进行,发酵操作成本明显降低,发酵性能得到提高。