布氏锥虫TatD-like DNase的表达与水解活性分析

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zwj_10061
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布氏锥虫(Trypanosoma brucei,T.brucei)是一类具有广泛宿主的血液内寄生原虫,其三个亚种可以引起人类和动物的非洲锥虫病。人类的非洲锥虫病又叫作睡眠病(sleeping sickness),感染后期病人出现神经症状,嗜睡昏迷,如不及时治疗,死亡率高达百分之百;动物的非洲锥虫病也叫作那加那病(nagana),引起家畜营养不良,贫血消瘦,最后因极度衰竭而死,给畜牧业发展带来了巨大的经济损失。中性粒细胞在病原体感染部位分泌形成细胞外DNA网络(neutrophil extracellular traps,NETs)是机体捕获及杀伤入侵病原的重要先天性免疫机制。许多病原可通过表达和分泌DNase降解NETs中的DNA结构,从而逃避其免疫作用。我们对布氏锥虫基因组进行分析,发现布氏锥虫含有两个编码TatD-like DNase的基因,在锥虫种内具有高度保守的结构域,该蛋白质可能在锥虫的发育繁殖过程中起到重要作用,本课题的目的是研究布氏锥虫的TatD-like DNase是否和其他病原微生物的DNase一样,参与了虫体逃避宿主先天性免疫应答。首先先从NCBI数据库中获得布氏锥虫TatD-like DNase的两个基因序列(TbTatD-1155和TbTatD-1005),经过序列优化合成基因,将两个基因分别克隆到p GEX-4T-1和p ET-28a表达载体中,通过大肠杆菌表达系统制备重组蛋白质。以r TbTatD-1155-His和r TbTatD-1005-His为免疫原,分别免疫实验动物,制备多克隆抗体,通过亲和层析纯化特异性Ig G。利用制备的特异性Ig G,通过Western-blot和IFA实验对TbTatD-1155和TbTatD-1005在虫体中的表达和分布情况进行分析,发现两个蛋白质均表达在虫体的胞浆、细胞表面及鞭毛部位。将r TbTatD-1155-GST和r TbTatD-1005-GST分别与宿主DNA共同作用,进行功能分析,发现两种蛋白质均能够降解宿主DNA分子,具有脱氧核糖核酸酶活性。用PMA体外刺激中性粒细胞,产生NETs结构,分别加入r TbTatD-1155-GST和r TbTatD-1005-GST共同孵育,发现两种蛋白质均能够降解NETs中的DNA,破坏NETs结构。提示布氏锥虫的TatD可能参与虫体逃避宿主NETs产生的先天性免疫应答。本研究已经初步验证了布氏锥虫TatD-like DNase的分布及体外水解DNA和NETs的功能,为进一步研究该蛋白质与虫体致病的相关性和研究布氏锥虫的先天性免疫逃避机制奠定基础。
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