背景和目的:Peutz-Jeghers 综合征(Peutz-Jeghers syndrome,PJS)是一种以皮肤粘膜黑斑、消化道多发错构瘤息肉为特征、具有高度肿瘤易感性的常染色体显性遗传病。临床突出表现为胃肠道大量息肉导致肠套叠、肠梗阻、消化道出血,且息肉复发率高;其临床发病率为1/50000-1/200000之间。PJS患者发生良、恶性肿瘤的风险明显高于正常人群(HR 8.96),大多数患者死于癌症(67%),其家族恶性肿瘤发病率也比普通人群高15倍。LKB1(Liver Kinase B1)基因是目前公认的PJS的致病基因,LKB1作为一种抑癌基因,通过细胞信号通路传导在细胞生长、细胞增殖、蛋白质合成、细胞凋亡、白噬以及能量代谢的应答调控等方面发挥重要作用。LKB1基因的突变(包括错义突变、剪切位点突变、碱基插入、大/小片段缺失/重复等)可导致LKB1激酶活性降低甚至失活,进而通过改变一系列信号通路来引起包括PJS、肺癌在内的多种疾病的发生。随着检测技术的进步,MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)技术、高通量测序的普及,全球范围内LKB1基因的新发突变不断被报道,目前在PJS患者及相关肿瘤患者中已检测出LKB1基因突变近300种,这为研究LKB1突变基因型与其对应的临床表型建立了基础平台。尽管目前已经确定了 LKB1是PJS的致病基因,但是因其致病机制复杂,至今未能明确阐明其致病机制。同时,LKB1基因不同位点的突变,所导致的细胞功能的改变也不尽相同,即突变的临床表型也可能不一样。本课题组在前期研究工作中已收集到52个中国PJS家系116例患者的生物样本及临床病理资料,通过基因测序发现中国PJS患者LKB1基因突变率达67.3%,这一突变率与国外报道基本相符(50-90%);共发现14种新的致病突变,其中37%的基因突变集中在LKB1基因第6号外显子末端和整个第七号外显了(该区域编码LKB1蛋白第Ⅺ功能区),我们高度怀疑该区域可能是中国PJS患者的突变热点;在对其临床表型进行回顾分析后发现,LBK1基因第Ⅺ功能区突变与PJS患者错构瘤性息肉发生不典型增生相关。但是目前尚无对该功能区点突变的功能学研究,其突变的致病机理尚不明确;我们根据PolyPhen2软件突变危害评分,选取了其中的p.M289R突变作为代表,构建了 LKB1基因野生型、p.M289R突变型稳定表达细胞株,深入分析了 LKB1基因在第Ⅺ功能区突变对细胞增殖、细胞周期、细胞自噬及其对LKB1-AMPK-mTOR通路的影响,并验证LKB1基因第Ⅺ功能区突变可能为PJS的致病性突变。材料和方法1.主要材料:SW480、SW1116、HT29、Hela、SW-620、293T、DLD1、HCT-116、LoVo细胞;Lipofectamine(?)3000 转染试剂、Trizol、RIPA Buffer、CCK-8 试剂盒、PI 染色剂、低温琼脂糖、LB 培养基、LKB1、p-AMPK(Thrl 72)、p-p70S6K(Thr3 89)、p70S6K、p-mTOR(Ser2448)、mTOR、4E-BP1、p-4E-BP1(Thr37/46)、S6K、p-S6K(Ser235/236)、p-S6K(Ser240/244)、cyclinD1、beclin1、LC-3B、p53 抗体。2主要方法:1)LKB1引物设计利用美国国立生物技术信息中心基因数据库查找LKB1基因的全长编码序列。从引用文献引物序列及用Primer 3.0自行设计扩增LKB1基因的引物;在说明书的指引下掌握引物反应条件。2)LKB1质粒的构建及鉴定空载体质粒pGCMV-GFP-Vecor、野生型质粒pGCMV-GFP-LKB1(WT)及突变型质粒pGCMV-GFP-LKB1(p.M289R)由上海吉玛公司构建,并经过上海生工公司测序再次鉴定。3)筛选LKB1基因不表达或低表达细胞株将 SW480、SW1116、HT29、Hela、SW-620、293T、DLD1、HCT-116、LoVo细胞常规培养于37℃,5%CO2的恒温培养箱中。用RIPA裂解液(已加蛋白酶抑制剂)裂解上述不同肿瘤细胞,用免疫印迹法(Western Blot)检测细胞中LKB1蛋白的表达水平,同时用 Trizol 裂解,通过 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction,逆转录-聚合酶链式反应)检测细胞中LKB1的mRNA表达水平。并从中筛选出LKB1基因不表达的SW1116、Hela细胞株作为实验用细胞,以开展后续实验。4)建立并检验目的基因的稳定表达细胞株分别将空载体pGCMV-GFP-Vector质粒、野生型pGCMV-GFP-LKB 1质粒和突变型 pGCMV-GFP-LKB1(p.M289R)质粒通过 Lipofectamine 3000 脂质体介导转染Hela、SW1116细胞,转染48小时后,加入对应浓度的G418筛选抗生素,进行单克隆筛选;最终建立LKB1基因野生型、突变型的稳定表达株及含空载体的稳定表达株。提取稳定表达细胞株中总mRNA、总蛋白,检测并比较LKB1在不同稳转细胞株中mRNA和蛋白水平表达的差异。5)各稳定表达细胞株在LKB1/AMPK/mTOR信号通路关键蛋白及P53蛋白表达的影响不同稳转细胞铺于6孔板内,在饥饿12小时后RIPA Buffer(已加磷酸化蛋白酶抑制剂及蛋白酶抑制剂)裂解细胞,Western Blot检测并比较不同转染组细胞中 p-AMPK(Thr 172)、AMPK、p-p70S6K(Thr389)、p70S6K、p-mTOR(Ser2448)、mTOR、4E-BP1、p-4E-BP1(Thr37/46)、S6K、p-S6K(Ser235/236)、p-S6K(Ser240/244)、cyclinD1、beclin1、LC-3B、P-53 等蛋白的表达。6)不同稳定表达细胞株对增殖活性的影响:计数不同稳转细胞株,1000个细胞/孔铺于96孔板内,在铺板后12h、24h、36h、48h、72h、96h 加入 CCK-8 试剂,并按 0.5h、1.0h、1.5h、2.0h 检测时间点测量检测450nM波长下各孔细胞的吸光值,比较不同稳定表达细胞株的细胞增殖活性。7)不同稳定表达细胞株对细胞克隆形成能力的影响:计数不同稳转细胞株,并每孔取2000个细胞分别溶于各1.5ml 0.3%琼脂混合液中,混匀后铺于已凝固的0.6%软琼脂的35mm培养皿内,每组设3个复孔,待其凝固,37℃,5%C02培养箱中常规培养两周后,0.05%结晶紫染色,PBS洗涤后镜下观察、计数并拍照。比较转染不同稳转细胞株对细胞克隆形成能力的影响。8)不同稳转细胞株对细胞周期的影响:用不含EDTA的胰酶消化细胞后,1100rpm离心5min,冷PBS洗两次;用75%乙醇固定细胞;12hours后,900rpm,离心5min;PBS缓冲液清洗2遍,加入含PI染色剂和RNA酶的工作液400ul,避光孵育15min后,行流式细胞术检测,比较不同组细胞周期的差异。9)数据统计利用SPSS 16.0软件分析数据,不同分组结果利用one-way ANOVA统计方法分析,方差齐者采用LSD、Bonferroni方法比较,方差不齐者则采用Dunnett T3方法为准比较。采用“算术平均值±标准差(geometricmeans±standarddeviation,M±S.D)"来表示数据,以P值<0.05视为有显著性差异。结果1.Western Blot和RT-PCR检测SW1116细胞与Hela细胞中不表达LKB1蛋白及其mRNA;并以这两种细胞建立了 LKB1野生型、突变型稳定表达株。2.Western Blot、RT-PCR 检测 Hela、SW1116 细胞对应的 LKB1 野生型、突变型稳定表达细胞株;与空白组相比,野生型和突变型稳定表达细胞株中,LKB1蛋白和mRNA的水平明显上调(P<0.05),但LKB1野生型与突变型在LKB1蛋白及mRNA在表达量无显著差异(P>0.2)。3.用Hela细胞、SW1116细胞对应的稳定表达细胞株进行CCK8(Cell counting Kit8)检测,结果显示与空白对照组、空载体组、突变型组细胞相比,野生型LKB1细胞组于450nm波长处吸光值(OD450)明显降低(P<0.001),而空白对照组与空载体组、突变型组之间吸光值无统计学差异(P>0.05),提示LKB1基因野生型组细胞增殖活性降低,LKB1基因突变组p.M289R的增殖活性强于LKB1基因野生组。4.用SW1116、Hela细胞对应的稳定表达细胞株进行软琼脂克隆形成实验发现,与空白对照组、空载体组、突变型组的细胞克隆数量相比,野生型组细胞克隆数量下降明显,具有统计学差异(P<0.001)。在SW1116细胞中,突变组与空白对照组、空载体组之间无显著差异(P>0.05);Hela细胞中,突变组的增殖能力低于空白对照组、空载体组(P<0.03)。即LKB1野生型组细胞克隆形成能力明显降低,而LKB1基因突变p.M289R则可使LKB1基因抑制细胞增殖的能力降低。5.流式细胞术检测SW1116、Hela细胞的野生型、突变型稳定表达株细胞周期分布显示,LKB1新突变p.M289R与LKB1野生型结果相比,在G1、G2、S期的百分比并无显著差异(p>0.3)。6.Hela细胞、SW1116细胞对应的稳定表达细胞株进行Western Blot实验显示:与空白对照组、空载体组和突变型组细胞相比,野生型细胞中AMPK蛋白的Thrl72位点磷酸化水平显著升高(P<0.01),但是AMPK总蛋白表达无显著差异(P>0.05);而在其下游信号mTOR通路中,与空白对照组、空载体组和突变型组细胞相比,野生型细胞中的p-mTOR(Ser2448位点)、P70S6K(Thr389 位点)、p-S6K(Ser235/236 位点)、p-S6K(Ser240/244 位点)、p-4E-BP1(Thr37/46位点)的磷酸化水平降低(P<0.01);相比之下,突变型组在上述磷酸化位点的表达弱于空白对照组和空载体组,但是要强于野生型组。提示LKB1基因野生型组细胞抑制了 AMPK-mTOR信号通路,而LKB1基因突变型p.M289R则是野生型基因的抑制作用减弱;7.各组细胞在自噬水平上的差异:与空白对照组、空载体组相比,野生型组、突变型组在LC-3B、Beclin1表达水平显著上调(P<0.05);但是LKB1野生型与突变型在LC-3B、Beclin1的表达量无显著差异(P>0.05)。8.各组细胞在p53蛋白表达水平上的差异:与空白对照组、空载体组相比,野生型组、突变型组在p53表达水平显著上调(P<0.05);但是LKB1野生型与突变型在p53的表达量无显著差异(P>0.05)。结论:1.筛选出SW1116、Hela细胞不表达LKB1基因;以SW1116、Hela细胞为基础建立了 LKB1野生型、LKB1新突变型、空载体的稳定表达株;LKB1突变型(p.M289R)对LKB1蛋白及mRNA的表达无明显影响;提示该突变可能不影响LKB1基因对LKB1总蛋白的的转录与翻译过程。2.软琼脂克隆形成实验及CCK-8实验证明LKB1基因突变(p.M289R)可使LKB1基因野生型抑制细胞增殖的能力降低,即LKB1基因突变(p.M289R)可增强细胞增殖的能力。3.LKB1突变(p.M289R)失去或者降低了 LKB1野生型基因对p-AMPK(Thr172位点)的激活能力。4.LKB1突变(p.M289R)使mTOR通路异常活化,并通过提高p-mTOR(Ser2448 位点)、P70S6K(Thr389 位点)、p-S6K(Ser235/236 位点)、p-S6K(Ser240/244 位点)、p-4E-BP1(Thr37/46 位点)的磷酸化水平,来达到促进细胞蛋白质合成、促进细胞增殖的最终效应;同时,与LKB1野生型基因相比,LKB1基因突变(p.M289R)在mTOR、P70S6K、S6K、4E-BP1蛋白的表达量上未见明显差异。5.与空白对照及空载体组相比,LKB1基因突变(p.M289R)以及LKB1野生型可增强细胞自噬水平;LKB1基因突变(p.M289R)与LKB1野生型相比,两者间自噬水平无明显差异;提示LKB1基因突变(p.M289R)引起细胞增殖能力的升高,与细胞自噬水平可能没有直接关系。6.LKB1基因突变(p.M289R)与LKB1基因野生型相比,并未引起细胞周期的明显改变;证实了 LKB1基因突变(p.M289R)使细胞增殖能力增强并非通过改变细胞周期的途径。7.与空白对照及空载体组相比,LKB1基因突变(p.M289R)以及LKB1野生型可增强细胞p53表达的水平;但是LKB1基因突变(p.M289R)与LKB1基因野生型相比,两者在p53蛋白的表达量上无明显差异(P>0.2),提示LKB1基因突变(p.M289R)引起mTOR通路的活化及细胞增殖并不通过p53的调节。LKB1基因在第Ⅺ功能区的点突变p.M289R可能是PJS的致病突变之一,其致病机制是通过LKB1的突变降低LKB1的激酶活性,异常活化了LKB1-AMPK-mTOR信号通路,增强了细胞的增殖能力;同时,这种增殖能力的增强可能与细胞自噬水平、细胞周期的调节及p53基因介导的mTOR通路调控无关。