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甜菊糖（Steviol glycoside）是一种具有很多优良特性的高甜度天然甜味剂，在食品、饮料、酿酒、医药、日用化工等领域均有着巨大的应用价值。甜菊糖带有后苦味和甘草异味，混合物组分复杂，难以对其质量规格进行统一，成为限制其应用的重要因素。甜菊苷（Stevioside）和莱鲍迪苷A（Rebaudioside A）是甜菊糖含量最丰富的两种成分，分别占干叶重的5-10%和2-4%。莱鲍迪苷A甜度最高，稳定性和水溶性较好，且不带有甜菊苷的苦涩味，具有巨大的应用价值。目前制备高纯度莱鲍迪苷A产品的方法：培育高产莱鲍迪苷A的甜叶菊品种、树脂吸附或重结晶提纯莱鲍迪苷A、环糊精转移酶等酶对甜菊糖进行改性等，但都存在工艺繁琐、成本高、效果不佳等缺点。甜叶菊（Steviarebaudiana Bertoni）UGT76G1已报道可特异性催化甜菊糖中含量高、苦涩味重的甜菊苷生成莱鲍迪苷A。利用基因工程技术，将UGT76G1成功展示在毕赤酵母细胞表面，为酶高效催化生产莱鲍迪苷A的工业化提供了前景。本研究通过密码子优化及全基因合成的方法获得甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）UDP-糖基转移酶UGT76G1基因。利用Gcw61p为锚定蛋白，实现UGT76G1在毕赤酵母GS115的表面展示。展示型重组菌GS115/pGCW61-KAS1经甲醇诱导，摇瓶发酵120h，菌体最高酶活为0.126U/g（Dry cell weight）。初步探究展示在毕赤酵母GS115细胞表面的UGT76G1的酶活性质：其最适反应pH值为8，最适反应温度为40℃，与酿酒酵母中表达的UGT76G1一致。但展示的UGT76G1的pH适用范围变宽，耐碱性和耐温性均有提高。在确定UGT76G1可在毕赤酵母细胞表面成功展示表达后，利用多拷贝串联表达盒重组质粒的构建，获得高拷贝重组毕赤酵母，以期提高UGT76G1的展示酶活。构建pHKA-K61载体，并在此基础上成功构建了2拷贝和4拷贝的串联表达盒重组质粒：pHKA-K61×2、pHKA-K61×4和pHKA-(K21-K61)×2。电转化宿主菌GS115，获得重组菌。对构建成功的重组毕赤酵母基因组内目的基因KAS1的拷贝数进行测定，得：GS115/pGCW61-KAS1（1copy）、GS115/pHKA-K61×2（2copies）、GS115/pHKA-K61×4（4copies）和GS115/pHKA-(K21-K61)×2（5copies）。以上四株重组菌经甲醇诱导，摇瓶发酵120h，分析发现多拷贝重组菌株的产酶活力（U/g）随菌体拷贝数的增加而增加，但生长情况都受到了相应程度的抑制。酶活力最高的菌株GS115/pHKA-(K21-K61)×2（5copies）在甲醇诱导72h达最高酶活0.479U/g（Dry cell weight）比单拷贝对照菌GS115/pGCW61-KAS1（1copy）最高酶活提高了将近3倍，但其生长OD600仅5~6，菌体生长明显受到抑制。GS115/pHKA-(K21-K61)×2（5copies）甲醇诱导72h的菌体进行酶活反应，约有1.361mg/mLRA生成，转化率约为70.37%（RA实际产量/RA理论产量）。