目的： 1.预测肿瘤相关抗原CEA的CTL、B细胞表位，可为肽段表位疫苗设计及其单克隆抗体的制备等研究提供理论依据。 2.经过肿瘤相关抗原CEA的CTL、B细胞表位预测分析，获得了8个B细胞表位多肽和19个HLA-A*0201限制性候选抗原表位肽，选用分值较高的CTL、B细胞表位并结合“非选择性”辅助T细胞表位，构建含CTL、Th和B细胞多表位的原核重组质粒pET32a/ozlf-86/87，用带有6个组氨酸标签(His.tag)的PET32a(+)原核表达系统表达表位融合蛋白，并通过Ni-NTA树脂亲和层析法纯化获得表位融合蛋白，即ozlf-86/87。 3.将纯化的表位融合蛋白ozlf-86/87作为抗原，采用间接ELISA方法检测CEA阳性大肠癌和胃癌肿瘤患者血清及健康对照者血清，初步分析表位融合蛋白的抗原性，为胃肠道恶性肿瘤相关疾病的疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定基础。 方法： 1、以肿瘤相关抗原CEA的完整氨基酸序列为基础，采用SOPMA、GOR、nnPredict和HNN4种方法分别预测CEA的二级结构：并结合其跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、极性和柔韧性等综合分析预测CEA可能的B细胞表位。用SYFPEITHI超基序法远程预测系统的预测方法对CEA的HLA-A*0201限制性CTL表位预测，选取预测分值均高于(Score＞20)的HLA-A*0201限制性CTL表位。 2、根据预测分析得到的表位氨基酸序列，选取预测分值较高的CTL表位(IMIGVLVGV)和B细胞表位(SNNSKPVEDK)，并结合“非选择性”辅助T细胞表位(AKFVAAWTLKAAA)串联起来，按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化，委托生物技术公司合成寡核苷酸，退火获得目的基因，并将目的基因克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内。将此重组载体转化E.coliBL21(DE3)表达融合蛋白，并经SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化表位融合蛋白ozlf-86/87。 3、用纯化的ozlf-86/87蛋白作为诊断抗原，与此同时，以His蛋白和PBS作为阳性对照和阴性对照。采用间接ELISA法分别对39例胃癌患者、25例结肠癌患者、30例健康对照者、30例慢性胃炎患者血清标本的CEA抗体效价检测，并分析其抗原性。根据健康对照组血清抗体的平均A值计算出阳性判定值(Cutoff值)(健康对照组血清抗体平均A值+2S)，以此评估胃癌患者和结肠癌患者血清抗体阳性检出率及ELISA方法诊断胃肠道恶性肿瘤的敏感度。 4.统计学分析：采用SPSS8.0统计软件进行分析，各组间血清抗体阳性率的比较采用x2检验法，显著性检验水平均为0.05。 结果： 1、采用SYFPEITHI法对CEA的HLA-A*0201限制性的CTL表位进行预测，获得了19条候选抗原表位多肽。通过多参数预测模型预测的第150～160、168～172、207～211、332～338、372～377、467～472、485～490、507～516和580～584区段是CEA最有可能的B细胞表位。 2、嵌合有多表位目的基因的原核重组质粒pET32a(+)/ozlf-86/87，进行酶切和测序鉴定，构建成功。SDS-PAGE分析表明，重组质粒在37℃1.0mMIPTG条件下诱导6h能很好地表达目的蛋白，相对分子质量(Mr)约为20kDa，与预期Mr大小吻合；蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的20％。并经Westernblot鉴定为目的蛋白。用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化成功获得表位融合蛋白，即ozlf-86/87，纯度达到90％以上。 3、以ozlf-86/87融合蛋白诊断抗原检测胃癌患者、结肠癌患者、慢性胃炎患者及健康对照者血清标本中CEA特异性抗体，均值分别为0.4037±0.295，0.5082±0.460，0.1108±0.068，0.0677±0.046，用方差检验分析，胃癌和结肠癌实验组与对照组血清抗体效价之间均有显著性差异(P＜0.01)。胃癌组和结肠癌组血清抗体效价没有明显统计学差异(P＞0.05)，慢性胃炎组和健康对照组血清抗体效价没有明显统计学差异(P＞0.05)。根据健康对照组血清抗体的平均A值计算出阳性判定值(Cutoff值)(健康对照组血清抗体平均A值+2S)为0.452，判断胃癌组、结肠癌组、慢性胃炎组和健康对照组抗体阳性率分别为35.9％(14/39)、44.0％(11/25)、0％(0)和0％(0)，胃癌组和结肠癌实验组和对照组阳性率差异均有显著性(P＜0.001)，慢性胃炎组与健康对照组阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论： 1.预测并筛选了8个可能的CEA的B细胞表位和19个HLA-A2限制性候选表位肽，为肿瘤疫苗的设计提供了理论基础。 2.通过分子克隆成功构建了整合有CTL、Th和B细胞多表位的原核重组质粒pET32a/ozlf-86/87，并在原核细胞表达系统内成功表达融合蛋白。 3.以ozlf-86/87融合蛋白作为诊断抗原，用ELISA法可以成功检测胃癌患者和结肠癌患者血清特异性抗体，ozlf-86/87融合蛋白具较强的抗原性。对胃肠道恶性肿瘤诊断试剂的研究和对下一步免疫效应研究奠定了基础。