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输血传播病毒(Torque teno virus, TTV)是一种小的,无囊膜的,单股环状负链的DNA病毒,目前该病毒被归于圆环病毒科的指环病毒属。TTV是继甲、乙、丙、戊型肝炎病毒之后又发现的一种新型肝炎病毒。该病毒最早是由日本学者于1997年从一例输血后发生急性感染的非甲~戊型肝炎病人血清中发现的,因而被称输血传播病毒。调查发现TTV在人群中感染率很高,在猪、牛、羊、猫、狗等多种动物体内也相继发现有TTV的感染。猪源TTV在全世界大部分猪场都具有很高的感染率,引起了人们的广泛关注。目前的流行病学调查显示,猪源TTV和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒共感染可诱发猪的皮肤肾炎综合症,和猪圆环病毒共感染可诱发断奶仔猪代谢综合症,还可能与猪圆环病毒或猪戊型肝炎病毒共同诱发猪的传染性肝炎。由于猪源TTV具有潜在的危害,目前对此病毒的了解非常少,因此对其进行相关的研究是非常必要的。本文根据GenBank上发表的PCV2基因组序列和TTV1和TTV2的非编码区(UTR)序列设计合成引物,分别建立了用于检测PCV2和TTV1、TTV2的PCR及巢式PCR方法。对来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品进行了检测,结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为37.6%和82.6%,二者的混合感染率为34.5%。94份样品表现为PCV2和TTV1的混合感染,占样品总数的36.4%;193份样品表现为PCV2和TTV2的混合感染,占74.8%;另外,还有一些样品为三重感染,占34.5%。挑选部分阳性样品用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分UTR片段,并将扩增出的部分UTR基因与已报道的TTV1和TTV2的UTR序列进行比较分析。分析结果显示本研究获得的TTV1毒株之间的UTR核苷酸同源性为80.8%-98.5%,TTV2毒株之间的UTR核苷酸同源性为94.2%-100%,而与参考株相比同源性分别为82.7%-100%和95.5%-99.1%。本研究从基因水平证实我国猪群中存在TTV的感染,提示我们TTV对猪群是一个不容忽视的新病原,并且确定了猪群中PCV2与TTV1和/或TTV2混合感染情况。从流行病学调查为阳性样品中选取其中病毒滴度高的样品,进行全长序列的扩增,测序过程中发现,在TTV1和TTV2基因组中均存在一段高GC并且有特殊结构的区域,导致测序结果不理想。针对这一问题,分别设计了2对和3对覆盖TTV1和TTV2全长的套式PCR引物,对阳性样品进行扩增,获得了7株全长序列,3株TTV1,4株TTV2。将所得到的TTV序列与GenBank中的10株参考序列进行核苷酸和氨基酸的比对和分析,核苷酸比对结果显示,获得的猪源TTV1和TTV2之间的同源性不到10%,TTV1分离株之间的核苷酸同源性为94.6-96.5%,与参考序列的同源性为61.5-98.3%,TTV2分离株之间的核苷酸同源性为92.4-94.8%,与参考序列之间的同源性为85.4-96.2%。氨基酸比对结果显示,TTV1分离株的ORF1,2,3的氨基酸同源性均97.5%以上,但与参考序列的同源性则分成了两种情况,与AB076001和GU456383参考序列的同源性在97.5%以上,而与其他4株参考序列的同源性则不到50%。TTV2分离株的ORF1,2,3的氨基酸同源性均在88.3%以上,而和参考序列的同源性均在80%以上,只与参考序列GU88046 ORF3的同源性出现了低于50%的例外。通过比较分析也发现,TTV三个ORF的氨基酸同源性普遍低于核苷酸的同源性。与此同时,还发现核苷酸同源性大于90%的TTV序列之间,存在高频率的G/A碱基互换,在TTV1的ORF1中,其互换率在40-57.6%之间,ORF2的互换率在50-60%之间,明显高于其他碱基之间的互换率,而在TTV2中核苷酸同源性大于90%的序列只有两株,其ORF1的G/A的互换率为27.7%和42.9%,高于其它碱基的互换,在ORF2中,互换率为60%,明显高于其他碱基的互换率。进一步的研究表明去甲基化能明显减小测序困难,其中对FJ/China/2010/TTV2/2的测序完全正常,对FJ/China/2010/TTV2/2的全长序列进行了GC岛、DNA二级结构的预测和甲基化水平分析,结果表明,在FJ/China/2010/TTV2/2的难测区和高GC区均存在复杂的茎环结构,但没有GC对的甲基化。对猪源TTV2中的假想蛋白ORF1,ORF2进行原核表达,由于ORF1 N端含有大量疏水氨基酸,因此对ORF1进行了截短,即ORF1a,表达结果显示ORF1a为包涵体,ORF2为可溶性蛋白。通过包涵体纯化和谷胱甘肽亲和层析(GST)纯化获得高纯度的可溶性重组蛋白,将纯化的ORF1a蛋白和ORF2蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,ELISA效价可达1:6000。另外,分别将TTV2的ORF1,ORF2和ORF3克隆到真核表达载体3×Flag中,构建了重组的真核表达质粒3×FLAG-ORF1,ORF2和ORF3。将其转染细胞,通过自制抗体的间接免疫荧光(IFA)试验证明了自制抗体的有效性,且通过3×FLAG标签抗体的IFA对三个假想蛋白进行了细胞定位,结果显示ORF1蛋白是核定位的,ORF2蛋白分布在整个细胞,ORF3蛋白主要集中在核浆中,在核仁的外围尤为明显。由于猪源TTV在猪体内的含量比较低,目前还没有能够支持其复制的细胞系,所以其分子机制和生物学的研究一直受到限制。为了研究猪源TTV的一些关键的分子生物学活性(如转录和复制),本研究分段扩增了FJ/China/2010/TTV2/2的全长序列,该序列全长2796个核苷酸,与最早分离出的TTV2原型Sd-TTV2p (AY823991)的同源性为85.4%,用该序列构建出了分别含有1.0个,1.3个,2.0个全长基因组的载体为pSK的质粒。通过将构建质粒转染PK15细胞,48h后的Northern Blot实验,验证了三个主要阅读框的存在和ORF3剪切的发生;通过基于酶切的Southern Blot实验进行了病毒复制的研究,没有检测到构建质粒在PK15细胞中的复制;用自制ORF1a,ORF2抗体,通过间接免疫荧光实验检测构建质粒的蛋白表达情况,在72h后能够用ORF1a抗体检测到ORF1的蛋白表达,但ORF2抗体没有检测到荧光。Northern Blot和IFA试验证明了我们所构建的猪源TTV感染性分子克隆的可行性。这些实验为研究TTV的分子生物学机制搭建了平台,也为找到可以培养TTV的细胞系奠定了基础。