胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）是胭脂鱼科（Catostomidae）在中国的唯一分布物种,为胭脂鱼属（Myxocyprinus）的唯一种,是我国特有的国家二级重点保护动物。生产实践中,胭脂鱼幼鱼由于急性氨氮中毒导致大批量死亡的现象常有发生,本研究首次测得胭脂鱼幼鱼分子氨安全浓度为0.036 mg/L,相比较同规格其他鱼类,其氨氮耐受力非常低,有潜力成为水体氨氮污染的一种新的生物指示种。目前胭脂鱼科在中国能收集到活体鱼类仅有两种,分别是原生种胭脂鱼和引进种美国大口胭脂鱼（Ictiobus cyprinellus）。本研究同样测得了同规格美国大口胭脂鱼的分子氨安全浓度为0.106 mg/L,远高于胭脂鱼的分子氨安全浓度,结合比较同规格其他鱼类,证明美国大口胭脂鱼氨氮耐受力较高,且显著高于胭脂鱼。两者亲缘关系相对较近,氨氮耐受力差异较大,故选择这两种胭脂鱼进行比较研究,以便更好探究氨氮胁迫及恢复的应答机制。本研究提出并验证了一种急性濒死浓度氨氮连续“胁迫-恢复”处理的实验方法。该方法模拟重现了实际氨氮急性中毒中的爆发时间短、可短时间内重复“胁迫-恢复”的特点,为研究鱼类氨氮急性胁迫致死机制提供了新的实验思路和方法。研究发现胭脂鱼在急性氨氮中毒时主要反应涉及组织病理、运动行为、呼吸代谢等方面,本研究首先从组织学、行为学、生理生化等方面,运用组织切片显微观察、动物运动轨迹跟踪测试（Noldus,Etho Vision XT）、呼吸代谢尺度表面积测定、Micro CT、静止代谢率测定、低氧阈值测定、血氨检测等方法,首次系统完整地展现了氨氮耐受差异较大的两种胭脂鱼在氨氮持续胁迫、氨氮胁迫及恢复整个过程中的组织病理、运动行为、呼吸代谢等方面的差异及变化规律。同时发现急性氨氮胁迫致死同缺氧胁迫存在一定程度的相似性和关联性,为进一步探究该问题,本研究最后通过三代全长转录组、二代连续比较转录组、实时荧光定量PCR、全胚胎原位杂交等分子生物学研究方法从基因水平来研究其应答机制。1.组织学方面,解析了氨氮胁迫下的器官组织病理损伤。通过常规氨氮胁迫96 h及恢复96 h实验,系统描述了胭脂鱼鳃、肝脏和肾脏的显微结构特征变化。胁迫96 h胭脂鱼的鳃、肝脏、肾脏等器官有一定不同程度损伤,受损程度相对较重的为鳃丝、肝脏,相对较轻的是肾脏。恢复96 h后均能表现出已处于恢复过程中,具有一定的恢复可塑性,但96 h仍不足以使其完全恢复,故组织病理损伤方面很难在极短时间内重复发生严重损伤与恢复这一过程。故推测鳃、肝脏、肾脏等器官的组织损伤仅在一定程度上会影响氧气等气体的呼吸交换和体内氨氮的代谢循环,但不是导致急性氨氮中毒迅速死亡的直接原因。2.行为学方面,解析了濒死浓度氨氮胁迫下的运动行为应答差异。通过动物运动轨迹跟踪测试得到运动轨迹、热图、移动距离、移动速度、高速运动状态、高加速运动状态及停滞状态等信息,系统描述展现了氨氮持续胁迫过程、氨氮连续―胁迫-恢复‖过程中两种胭脂鱼运动行为的应答特点和变化规律。面对氨氮持续胁迫处理（持续2.5 h）,发现氨氮耐受力低的胭脂鱼胁迫组的运动轨迹路线及热图比对照组明显紊乱无序,即趋触性被打破;耐受力高的美国大口胭脂鱼无显著差异,轨迹规则有序集中在测试箱四周,呈现正常趋触性。面对相同高浓度氨氮胁迫,两种胭脂鱼均采取了类似应对低氧胁迫的降低平均运动速度的低能耗状态应对氨氮胁迫,胁迫初始速度均显著高于对照组,呈现出应激爆发游泳状态。速度下降的策略会与自身氨氮耐受力及响应策略有关。结合多运动参数分析,胭脂鱼维持了较长时间的应激加速运动状态,而美国大口胭脂鱼则能迅速反应降低其速度,应激水平迅速降低。胭脂鱼持续胁迫2.5 h后已无法回救,而美国大口胭脂鱼仍可回救,其应激表现与鱼类缺氧症状类似,推测急性濒死氨氮浓度胁迫过程中应激行为表现越强烈,耐受力往往越低,死亡概率越大。面对氨氮连续―胁迫-恢复‖处理（正常0.5 h-胁迫0.5 h-恢复0.5 h-再胁迫0.5 h-再恢复0.5 h）,耐受力低的胭脂鱼运动轨迹及热图对应出现了“正常-紊乱-正常-紊乱-正常”的应答,轨迹紊乱程度不断加深,而耐受力高的美国大口胭脂鱼一直保持相对正常,变化不大。结合多运动参数分析,瞬时平均速度、高速运动状态时间、高加速度时间等指标受到氨氮胁迫时,两种鱼均采取了类―W‖型变化应答,随着往复次数的增加,胭脂鱼恢复程度更弱。停滞时间方面,美国大口胭脂鱼呈类―M‖型变化,而胭脂鱼持续上升,未能出现恢复调节。根据两种胭脂鱼的行为应答差异,推测急性濒死浓度氨氮胁迫可以通过改变鱼类应激行为状态,调控应激代谢水平,来不同程度适应氨氮胁迫与恢复,这还需要通过呼吸代谢水平相关实验进一步探究。3.生理生化方面,解析了濒死浓度氨氮胁迫下的呼吸代谢应答差异。低氧胁迫结果证明胭脂鱼的低氧耐受力弱于美国大口胭脂鱼;氨氮协同处理后,数据的离散度减小,使其应答更具一致性,且临界氧浓度、临界耗氧率均变小,证明缺氧状态下,高浓度氨氮协同处理会进一步显著降低鱼类低氧耐受力。面对氨氮连续―胁迫-恢复‖处理,两种胭脂鱼呼吸频率均呈现出类―W‖型调控,胭脂鱼呼吸频率均值高于美国大口胭脂鱼。两者的静止代谢率存在较大差异,胭脂鱼表现出总体下降的趋势,并未随着恢复而恢复变化;美国大口胭脂鱼表现出类―W‖型调控,与自身的呼吸频率变化类似。这与已有鱼类响应低氧胁迫研究相类似,鱼类代谢率会随环境溶氧水平的下降而降低,整体生理功能也随之降低。两种胭脂鱼的血氨浓度均呈现出类―M‖型变化,随着时间的推移,胭脂鱼变化幅度小于美国大口胭脂鱼,美国大口胭脂鱼后期仍能有较强的恢复能力,这可能是胭脂鱼比美国大口胭脂鱼氨氮耐受能力弱的一种表现。美国大口胭脂鱼血氨浓度并非一直低于胭脂鱼,随着往复处理的推移,两种鱼血氨浓度的最高峰值接近,同样面对高浓度血氨,胭脂鱼的中毒程度比美国大口胭脂鱼严重。推测氨氮进入鱼体后,高浓度的血氨激发了各自复杂的基因水平调控以应答调节高浓度血氨带来的胁迫,两种胭脂鱼在基因应答层面上可能存在差异,进而导致耐受力的差异。4.分子生物学方面,浅析了濒死浓度氨氮胁迫下的基因应答策略。在糖代谢相关基因中,筛选发现glul基因在胭脂鱼中呈持续显著上升趋势,在美国大口胭脂鱼中无显著变化。ucp2基因在两种胭脂鱼中均显著上升,但胭脂鱼中上升倍数明显大于美国大口胭脂鱼。大量糖代谢相关基因在氨氮胁迫后表达升高,表明氨氮胁迫可能造成了胭脂鱼能量消耗增加,应激程度增强。在免疫相关irf1、zc3h12a、cxcr4、irf4、cd9等基因的表达调控有差异性。推测因为该浓度胁迫下,胭脂鱼中多数与免疫相关的基因表达受到了抑制,表达量持续下降,对应抵御氨氮的免疫防线可能被打破,该分子氨浓度对于胭脂鱼来说就处于了较高的濒死浓度。反观美国大口胭脂鱼,该浓度胁迫下,多数免疫相关基因未完全受到抑制,与氨氮胁迫呈现类―M‖型或类―W‖型的表达调节现象,对应抵御氨氮的免疫防线可能未被打破仍在发挥调节作用。在缺氧诱导因子相关的基因中,发现hif1a基因在两种胭脂鱼中表达趋势一致,后期出现显著上升,但美国大口胭脂鱼的上升变化幅度要低于胭脂鱼。hif3a基因在胭脂鱼中呈持续显著上升,而美国大口胭脂鱼直至最后才开始显著上升,且变化幅度低于胭脂鱼。氨氮胁迫下机体表现出了类似缺氧的基因应答反应。这提示在水体溶氧充足条件下,高浓度氨氮急性胁迫仍会导致鱼体出现不同程度缺氧现象,推测这可能是生产实践中短时间内爆发高浓度氨氮急性致死的一个重要原因。研究首次发现两种胭脂鱼中的sik1基因的表达与氨氮胁迫、低氧胁迫具有紧密的联系,可能是鱼类响应的关键基因,经模式动物斑马鱼（Danio rerio）原位杂交验证,结果证明其在应对氨氮连续―胁迫-恢复‖、低氧连续―胁迫-恢复‖处理过程中表达趋势保守一致,呈类―M‖型的规律性调控,推测sik1基因可能在鱼类应对氨氮胁迫、低氧胁迫中发挥重要调节作用或伴随指示作用,这为后续研究提供新的见解。