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番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染是由MDRV引起番鸭和半番鸭高发病率和高死亡率的急性传染病,给番鸭养殖业造成严重的经济损失。MDRV与鸡源禽呼肠孤病毒(ARV)同属于正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)第 Ⅱ亚群的禽正呼肠孤病毒(Avian orthoreovirus),但二者基因组构成及致病特性又有所差异,特别是S组蛋白变异性较大,且它们与病毒致病性密切相关。已有报道指出MDRV与ARV均可以刺激干扰素产生,而ARV σA蛋白具有抵抗宿主干扰素(IFN)效应的功能,且其与MDRV σA蛋白基因同源性为76.5%,因此,可以推测MDRV σA蛋白在调控干扰素表达中扮演重要角色。鉴于此,本研究探索了 MDRV σA蛋白对干扰素信号通路的调控作用,主要内容及结果如下:1.为了初步确定MDRVσA蛋白能否像ARV σA蛋白一样有抑制干扰素IFN-α和IFN-β的功能,将含有MDRV σA基因的重组表达质粒转染DF-1细胞,培养24h后进行MDRV感染,通过ELISA方法检测σA蛋白对干扰素的影响。结果显示,MDRV感染组IFN-α和IFN-β表达水平均极显著高于空白对照组(P<0.01),说明MDRV可以刺激细胞干扰素的产生;空载体对照组(EV)组和σA组干扰素含量差异不显著(P>0.05),说明单独转染σA蛋白并不能显著刺激细胞干扰素的表达;EV+MDRV组的干扰素表达量显著(P<0.05)低于MDRV组和EV组,可能是由于EV组的刺激产生一定量的干扰素,使MDRV反而下调细胞干扰素的表达,这与ARV具有双向调节功能报道一致;而σA+MDRV组的干扰素表达量极显著高于EV+MDRV组(P<0.01),说明σA可能具有上调MDRV诱导的干扰素表达的功能,这与已经报道的ARV σA蛋白研究的结果不一致。为了进一步验证上述结果,我们通过Real-time PCR进一步检测σA蛋白对病毒诱导干扰素及其信号通路相关因子mRNA水平的影响,结果为:(1)干扰素检测结果显示,与空白对照组相比,MDRV组的IFN-α和IFN-β mRNA水平显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)升高;EV组和σA组干扰素含量差异不显著(P>0.05);EV+MDRV组的干扰素表达量显著(P<0.05)低于MDRV组和EV组;而σA+MDRV组的干扰素表达量极显著高于EV+MDRV组(P<0.01),这些结果均与ELISA检测结果基本一致。(2)干扰素信号通路相关因子的检测结果显示:与空白对照组相比,MDRV组的转录因子IRF7显著(P<0.05)升高,其模式受体(MDA5,TLR3和TLR7)以及抗病毒因子(Mx、ISG12和IFIT5)的mRNA水平均极显著(P<0.01)升高;EV+MDRV组的各因子的mRNA水平均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于MDRV组,同时低于或显著(P<0.05)低于EV组;σA+MDRV组各因子的mRNA水平均极显著(P<0.01)高于EV+MDRV,以上这些因子的检测结果均与干扰素表达结果基本一致。综上结果表明,MDRV σA蛋白可以上调MDRV诱导的干扰素及其信号通路相关因子的表达。2.由于试验中发现EV+MDRV组的干扰素及其通路相关因子的表达量均较EV组和MDRV组明显降低,猜测可能由MDRV具有双向调节干扰素的功能所致,为了排除这个因素的影响,进一步验证σA蛋白的功能,我们选用只有正向调控作用的激活剂poly(I:C)替代MDRV,并采用同样的试验方法,检测σA蛋白对激活剂poly(I:C)诱导的干扰素及其信号通路相关因子的影响。结果为:(1)Real-time PCR结果显示:与空白对照组相比,poly(I:C)组除IFIT5与ISG12的表达水平显著(P<0.05)升高外,其 IFN-β、MDA5、TLR3、IRF7 和 Mx的表达水平均极显著(P<0.01)升高,说明poly(I:C)可以有效激活干扰素信号通路的以上各因子mRNA的表达;EV+poly(I:C)组的mRNA表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于poly(I:C)组和EV组,对比前面的实验结果,可以间接说明MDRV具有双向调节干扰素表达的功能;σA+poly(I:C)组的各因子的mRNA表达水平均极显著(P<0.01)高于EV+poly(I:C)组及其他各组;表明σA蛋白能增强poly(I:C)诱导的干扰素及其通路相关因子的mRNA表达。(2)ELISA检测结果显示,以上各个因子表达量变化均与Real-time PCR的检测结果基本一致。综上表明,σA蛋白能增强poly(I:C)诱导的干扰素及其信号通路相关因子的表达。3.为了确定MDRV σA蛋白的第155和273位氨基酸残基是否是该蛋白发挥调控干扰素功能的关键位点。我们首先构建了MDRV-YB σA基因的三个突变体体(155Ala点突变,273Ala点突变以及155Ala+273Ala双突变),并在DF-1、Vero细胞系中成功表达;随后将野生型σA及其突变体分别转染DF-1细胞,培养24 h后转染poly(I:C),通过Real-time PCR和ELISA的方法检测其对干扰素及干扰素信号通路相关因子的影响。结果为:(1)Real-time PCR结果显示,σA155突变组和σA273突变组的IFN-β3和干扰素信号通路相关因子 MDA5、TLR3、IRF7、IFIT5、ISG12 和 Mx 的 mRNA 表达水平均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于EV组,但各因子(除TLR3外)的mRNA表达水平均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于野生型σA组,说明单突变均能显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)抑制σA蛋白增强poly(I:C)诱导的干扰素及其信号通路蛋白的表达的功能,但不会使σA蛋白失去该功能;σA155,273双突变体组各因子的mRNA表达量均极显著(P<0.01)低于野生型σA组,且除TLR3和MDA5外,其余各因子均与EV组差异不显著(P>0.05),说明双突变能极显著抑制或使σA失去增强poly(I:C)诱导的干扰素及其相关通路蛋白的表达功能;此外,σA155突变组与σA273突变组的各因子(除ISG12外)mRNA表达水平均差异不显著(P>0.05),且除TLR3,Mx,MDA5外,均极显著(P<0.01)高于σA155,273双突变体组。(2)ELISA结果与Real-time PCR结果基本一致。以上结果表明,155Arg和273Arg是σA蛋白的关键位点,突变会显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的抑制该蛋白增强poly(I:C)诱导的干扰素及其相关通路蛋白的表达,且证实双位点突变比单位点突变的抑制效果更为显著(P<0.05),甚至使该蛋白失去增强poly(I:C)诱导的干扰素及其相关通路蛋白的表达。综上,MDRV σA增强MDRV、poly(I:C)诱导的干扰素及其信号通路相关因子的表达,发挥调控干扰素关键位点为155Arg和273Arg。本研究从细胞信号转导角度揭示了 MDRV σA对宿主天然免疫影响的分子机制,为更深一步探讨该蛋白的功能机理提供基础,也为防治MDRV感染提供了新的思路。