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对虾养殖是重要的海水养殖产业,但养殖过程中病害频发使养殖业蒙受重大损失。为了有效的防控病害,需要深入探究对虾先天免疫机制。乙酰化修饰在生物体内是一种重要的表观遗传学修饰,与先天免疫反应调节及先天免疫记忆(训练免疫)相关。对虾中存在多种组蛋白去乙酰化酶(HDAC)及组蛋白乙酰转移酶(HAT)参与乙酰化修饰,但是它们在对虾先天免疫中的功能研究报道较少,本论文对对虾体内的去乙酰化酶在先天免疫及先天免疫记忆中的功能进行了研究。1.组蛋白去乙酰化酶3调控组蛋白H3K27乙酰化修饰促进对虾抗细菌免疫乙酰化修饰是一种广泛研究的表观遗传修饰,此种可逆的动态修饰在生物体内由组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferases,HATs)及组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)共同催化。研究发现乙酰化修饰不仅发生在组蛋白上,影响着染色质核小体的组装构建、结构变化以及基因表达调控等,同时乙酰化修饰还存在于非组蛋白,对生物体内与生长发育、新陈代谢、疾病发生等相关的多种信号通路起调控作用。HDACs是一类锌离子依赖性金属蛋白酶,具有促进蛋白质去乙酰化、调控基因转录和蛋白质活性及核质定位等功能。目前对哺乳动物HDACs的功能研究较为透彻,无脊椎动物中的研究很少。为了研究组蛋白去乙酰化酶在对虾先天免疫中的功能,我们通过对日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的转录组数据分析,筛选鉴定了 5种组蛋白去乙酰化酶(HDACs),其中Ⅰ类HDACs包括:HDAC1、HDAC3、HDAC8,Ⅱ类 HDACs 包括:HDAC4 和 HDAC6。表达模式分析显示,这些HDACs在日本囊对虾受到鳗弧菌(Vibrio.Anguillarum侵染后都上调表达。在哺乳动物中组蛋白去乙酰化酶3在促炎症因子表达、癌症发生、生物发育和细胞分化等生命过程中具有重要作用。在无脊椎动物先天免疫及免疫基因表达中的功能报道较少。因此我们选择组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)进行功能和机制的研究。我们首先利用RNA干扰的方法敲低Hdac3表达,然后进行弧菌感染,检测对虾体内的细菌载量和对虾的成活率。发现对虾血淋巴及胃肠道内的细菌数目明显增多,对虾存活率显著下降。随后我们对HDAC3调控对虾抗菌免疫的可能机制开展了研究,发现敲低Hdac3的表达并进行弧菌感染后,对虾的抗菌肽基因如抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,Alf)表达量都明显降低。为了确定HDAC3的功能,我们利用HDAC3的选择性抑制剂RGFP966抑制对虾体内HDAC3的活性,同样发现抗菌肽Alf-b1、Alf-c1、Alf-c2、Alf-d1基因表达显著降低,血淋巴以及胃肠道细菌数目明显增多。进一步的机理研究发现,对虾受到鳗弧菌侵染后,会刺激其血细胞中HDAC3由细胞核向细胞质中转运,并导致细胞核内染色质H3K27乙酰化修饰增强,并可能促使细胞质中转录因子STAT、Dorsal等向细胞核内转移,最终调控下游抗菌肽基因表达。因此组蛋白去乙酰化酶3在对虾体内通过调节组蛋白乙酰化修饰及转录因子核质迁移来调控对虾的抗细菌免疫。2.组蛋白去乙酰化酶3对虾抗细菌训练性免疫中的功能训练性免疫的发现颠覆了经典先天免疫无记忆性的观点,目前的研究表明,对虾中存在训练性免疫,但对产生训练免疫的机理还不清楚。为了研究对虾训练免疫的机理,我们首先建立了灭活鳗弧菌诱导日本囊对虾训练免疫的实验模型。通过该模型我们发现灭活的鳗弧菌致敏可以诱导对虾的非特异性训练免疫。对虾饲喂鳗弧菌“疫苗”进行免疫致敏,经过7天静息期后再感染鳗弧菌或白斑综合征病毒(WSSV),然后检测对虾体内的细菌或病毒载量和成活率。结果发现与对照相比,对虾体内细菌或WSSV的数量显著降低,对虾成活率明显提高。同时还发现免疫防御相关的基因如Alf-c2、Crus 1-2、ProPO以及Toll1的表达具有更快更强的特点。我们还对可能的机理进行了初步探讨,注射HDAC3的抑制剂RGFP966到灭活鳗弧菌处理的对虾,并分析对虾体内细菌数目及存活率。结果显示RGFP966可以阻断灭活鳗弧菌诱发对虾训练免疫,降低对虾存活率。这些结果提示与HDAC3相关的乙酰化表观遗传学修饰在抗细菌训练免疫中起着重要作用。具体的机理还需要进一步研究。