【摘 要】
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肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）是一种公认的安全的食品级革兰氏阳性菌,肉葡萄球菌胞外蛋白酶水解活性极低,故可以用作良好的基因工程宿主菌。蛋白质分泌至胞外的过程需要信号肽,目前存在两种主要的分泌途径,即一般分泌（Sec）途径和双精氨酸转运（Tat）途径。本论文通过相关技术手段选择较适合肉葡萄球菌胞外蛋白表达的信号肽,并以此信号肽构建表面展示体系。本论文首先构建无信号肽、含
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肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）是一种公认的安全的食品级革兰氏阳性菌,肉葡萄球菌胞外蛋白酶水解活性极低,故可以用作良好的基因工程宿主菌。蛋白质分泌至胞外的过程需要信号肽,目前存在两种主要的分泌途径,即一般分泌（Sec）途径和双精氨酸转运（Tat）途径。本论文通过相关技术手段选择较适合肉葡萄球菌胞外蛋白表达的信号肽,并以此信号肽构建表面展示体系。本论文首先构建无信号肽、含有Tat信号肽、含有SPP信号肽的表达红色荧光蛋白Ds Red-Monomer的RFP质粒,即S.carnosus/p BT2-RFP、S.carnosus/p BT2-ET-RFP、S.carnosus/p BT2-SPP-RFP。通过荧光分光光度计观察发酵上清液中RFP的红色荧光强度,可以清楚地看到S.carnosus/p BT2-SPP-RFP的荧光强度较强于S.carnosus/p BT2-ET-RFP,证明SPP信号肽的分泌效果较Tat信号肽强。之后以SPP信号肽为前导肽,构建肉葡萄球菌表面展示系统,即S.carnosus/p BT2-SPP-RFP-ABP-XM。表面展示转化株通过溶菌酶处理,使用荧光显微镜观察荧光效果,荧光变暗,证明RFP成功展示在肉葡萄球菌表面。其次,以LIP（Lipase来自变形杆菌）替换RFP,构建以上四种质粒,即S.carnosus/p BT2-LIP、S.carnosus/p BT2-ET-LIP、S.carnosus/p BT2-SPP-LIP和S.carnosus/p BT2-SPP-LIP-ABP-XM。通过分光光度计测定发酵上清液和菌体表面LIP的酶活,再次证明SPP信号肽的分泌效果较Tat信号肽强,LIP表面展示转化株菌体酶活为1132.62 U/g干细胞,是其他类型转化株的2-3倍,也可证明LIP在肉葡萄球菌细胞壁上锚定成功。表面展示转化株通过溶菌酶处理,使用分光光度计测定菌体酶活显示降低明显,再次证明LIP成功展示在肉葡萄球菌表面。最后,本论文进行了肉葡萄球菌表面展示LIP的酶学性质及储存稳定性的研究。全细胞表面展示脂肪酶的反应最适p H为10且稳定,反应最适温度为40℃且稳定性较好。Mg2+对肉葡萄球菌表面展示脂肪酶具有较好的促进作用,是未处理全细胞酶的115%。Mn2+、Fe2+对全细胞脂肪酶的抑制作用最严重。正己烷对全细胞酶活有促进作用,为未处理全细胞的120%。表面活性剂对表面展示脂肪酶活都有一定的抑制作用,其中0.1%Tween80的抑制作用最小。测定4℃时表面展示脂肪酶30 d的稳定性,结果全细胞酶仍能保持90%的活性,证明肉葡萄球菌表面展示LIP的储存性较好。
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