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淋巴管在肿瘤生长、转移过程中发挥着重要作用。淋巴管因其结构和功能的特点,不仅参与维持肿瘤的生长,而且也是多种恶性肿瘤细胞扩散的主要途径,尤其在淋巴管丰富的器官更为突出。淋巴结受累与否是多种类型肿瘤分期和直接针对引流区淋巴结治疗的基础,也是评判肿瘤预后的重要指标。微淋巴管新生(淋巴管生成)是近年来对肿瘤淋巴管研究的重大发现之一。肿瘤细胞通过分泌促淋巴管生成因子VEGF-C和/或VEGF-D,通过与淋巴管内皮细胞表面的VEGFR-3结合,诱导后者磷酸化激活,而启动肿瘤淋巴管生成,进而促进肿瘤转移。多种恶性肿瘤经研究证实存在着淋巴管生成过程,肿瘤淋巴管生成促进了肿瘤转移的发生。而肿瘤淋巴管生成建立起异于正常淋巴引流途径,可能是制约临床肿瘤根治性切除的重要因素。胆管癌是肝胆外科常见的恶性肿瘤之一。由于其早期诊断困难,癌细胞容易通过淋巴管、血管、神经周围间隙等途径发生转移,因此,尽管目前针对不同部位胆管癌有了成型的手术方案,但肿瘤术后复发率仍较高。本课题正是基于胆管癌主要通过淋巴转移的特点,在研究胆管癌微淋巴管状况的基础上,进一步通过体内和体外实验观察肿瘤组织的淋巴管生成情况,并利用微淋巴管对活性染料的吸收作用,研究荷瘤裸鼠肝门部胆管原位胆管癌种植瘤淋巴引流特点,以期指导临床胆管癌手术治疗。本课题主要采用了CD31/Ⅳ型胶原免疫组化双重染色、5′-核苷酸酶染色及透视电镜技术对胆管癌淋巴管分布、数量及结构特点进行观察。免疫组化SP法分别检测VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3和Ki-67的表达及分布。而RT-PCR及Western Blotting被分别用于检测VEGF-C mRNA及蛋白的表达。首先,课题对59例临床胆管癌手术切除标本的淋巴管解剖学特点进行了观察。结果显示:癌周边区淋巴管密度明显高于正常区, 癌内仅见少量塌陷的淋巴管。癌周毛细淋巴管腔形状不规则,其管壁仅由一层完整的内皮细胞构成,管腔多有不同程度的扩张,也有的形成狭窄的腔隙。毛细淋巴管内皮外缺乏基底膜,细胞间的连接也趋于简单,出现大量的开放间隙及断裂开放。部分标本可见肿瘤细胞贴附在淋巴管壁上,并伸出伪足进入管腔内。基于临床胆管癌手术切除标本,课题进一步观察了胆管癌淋巴管生成情况。研究发现:胆管癌组织促淋巴管生成因子VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显上调。<WP=11>VEGF-C表达与肿瘤淋巴结转移、癌旁微淋巴管密度密切相关。在发生淋巴结转移的胆管癌组织,VEGF-C表达阳性率显著高于未发生淋巴结转移组(P<0.05)。VEGF-D虽在胆管癌组织中的表达亦有所上调,但阳性比例显著低于VEGF-C。VEGFR-3在肿瘤细胞、癌旁淋巴管及血管内膜均有表达,并与VEGF-C的表达正相关。连续切片染色还观察到部分癌旁淋巴管内皮细胞Ki-67阳性染色。为验证胆管癌的淋巴管生成,我们成功地采用Transwell微孔滤膜/人工基底膜侵袭模型筛选得到胆管癌QBC939细胞株高、低转移性亚群。与最初的高侵袭转移能力细胞亚群VEGF-C表达可能上调的设想相异的是,体外基础培养条件下高、低转移性亚群间VEGF-C表达无明显差异。而 与3T3细胞混合培养后,高、低转移性亚群VEGF-C表达略有上调,其中高转移性亚群VEGF-C上调幅度略高于低转移性亚群。在将不同转移能力的细胞亚群接种裸鼠后,则观察到两亚群的肿瘤细胞的mRNA有显著增高,而高转移亚群组VEGF-C 的表达显著高于低转移性亚群组(P<0.05),但瘤周微淋巴管密度仅表现为轻度增高(P>0.05)。体外实验显示尽管成瘤后胆管癌细胞VEGF-C上调,但与之相应的微淋巴管密度增高并不显著。为进一步验证胆管癌的淋巴管生成状况,基于荷瘤裸鼠体内反复筛选得到的胆管癌高转移特性种植瘤被用于淋巴管生成的诱导观察实验。在体反复筛选得到的高转移特性种植瘤,与未经筛选的种植瘤比较,前者接种皮下成瘤后瘤旁微淋巴管密度、VEGF-C mRNA及蛋白水平均高于后者。动态观察该高转移特性种植瘤皮下种植后不同时相点瘤旁淋巴管密度的演进规律,结果显示:种植瘤形成的前三周,癌旁淋巴管数量均较少;四周后见瘤周淋巴管密度增加渐趋明显;至第六周,淋巴管密度显著增加。而种植瘤VEGF-C mRNA及蛋白表达与上述趋势基本一致,但高峰在第五周,并在第六周有所下调。对高种植瘤组织行VEGF-C反义寡核苷酸瘤旁注射,观察到其可下调上述高转移性种植瘤细胞VEGF-C mRNA及蛋白表达,而肿瘤微淋巴管密度亦明显降低。本研究还通过建立裸鼠肝门部胆管原位胆管癌种植瘤模型,运用生物活性示踪剂异硫蓝,对裸鼠肝门部胆管种植癌微淋巴管功能引流及肿瘤淋巴侵袭特点进行了研究。结果发现,肝门部胆管种植瘤淋巴管功能引流可分为,前组:肝十二指肠韧带前缘向下走行,沿肝固有动脉走向。后侧组:肝门至门静脉后走向。左侧组:在肝十二指肠深部,沿门静脉的前方向左侧,达到腹腔动脉和肠系膜上动脉走向。右侧组:沿胆总管右侧至十二指肠右侧至下腔静脉右侧淋巴结走向。对淋巴管行核苷酸酶染色、连续切片HE染色,发现:除前组外,于不同的淋巴管走向均可在某些实验动物上观<WP=12>察到淋巴管内见肿瘤细胞或肿瘤细胞的管壁浸润。以上的研究结果表明:1.胆管癌癌旁淋巴管具有管腔大,管壁薄,基底膜缺乏或不连续,细胞间连接趋向简单的特点,而在毛细淋?