P2X受体家族是一类细胞膜上以胞外ATP(Adenosine Triphosphate)为配体的非选择性阳离子通道。P2X受体广泛分布于人体的各个组织器官中,因此参与人体多种重要的生理活动,如炎症反应、神经递质的释放以及神经性疼痛等。　　 伊维菌素IVM(Ivermectin)是一种大环内脂类分子,可特异增大P2X家族P2X4离子通道电流并显著延长通道失活时间τoff(Deactivation time),但对P2X家族其它类型通道没有影响。　　 Khakh等人研究表明不同浓度IVM对P2X4离子通道的作用不尽相同:高浓度与低浓度IVM都可显著增大P2X4通道电流,但高浓度IVM可明显增强ATP与受体结合,延长P2X4离子通道在撤去ATP后的τoff值,而低浓度IVM没有这种作用。Silberberg的研究认为IVM与受体的结合是一种别构作用;IVM与通道的结合部位是位于亚基TMs(Transmembrane domains)之间的疏水间隙;IVM与ATP结合P2X4通道的部位不重叠。基于前人的研究,本课题提出以下假设:1,给予低浓度IVM时,P2X4通道结合一个IVM分子,而应用高浓度IVM时,P2X4受体结合2～3个IVM分子,两个IVM共同作用稳定ATP与受体的结合;2,高浓度IVM间接稳定ATP与受体结合,推测靠近TMs的胞外区是高浓度IVM效应的响应部位;3,该部位上侧链较大的苯丙氨酸可能是高浓度IVM作用的响应位点。　　 本课题目的在于鉴定靠近跨膜区的胞外区中影响高浓度IVM稳定大鼠P2X4离子通道与ATP结合的苯丙氨酸。HEK293T为ratP2X4蛋白表达载体;利用反向PCR技术向ratP2X4 WT中引入丙氨酸点突变并通过膜片钳全细胞记录模式记录电生理数据。课题选取ratP2X4受体上200、319以及330位苯丙氨酸作为丙氨酸点突变位点。　　 实验结果表明:突变体均可形成功能性离子通道;与WT相比,F319A在高浓度IVM作用时的τoff基本不变,F200A的τoff明显降低,而F330A的τoff则有所增加;突变没有改变ATP对ratP2X4Rs的效能;IVM与F330A的结合能力有所加强。因此得出结论:F200是通道胞外区对高浓度IVM效应的一个响应位点;F330位点影响IVM与受体通道的结合,可进一步验证该位点是否会影响高浓度IVM的效应。