目的和意义单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein1, MCP-1),又名CC-化学因子配体2(CC-chemokine ligand2, CCL2),是CC类趋化因子,可以通过激动单核v巨噬细胞表面的CCR2受体而将细胞定向趋化至病灶。越来越多的证据表明MCP-1和CCR2不仅表达于单核、巨噬细胞,还表现于平滑肌细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞及乳腺癌、肺癌、前列腺癌、骨髓瘤[1]等肿瘤细胞表面,与肿瘤的发生、发展及转移癌靶器官的选择密切相关。所谓MCP-1/CCR2生物学轴是指由趋化因子MCP-1与其特异性受体CCR2相互作用而构成的一个与细胞间信息传递、细胞迁移有密切关系的耦联分子对,其实质是CCR2对其配体MCP-1的高度亲和力和绝对特异性。由于MCP-1/CCR2对单核细胞/巨噬细胞的趋化作用,MCP-1在与此相关的慢性炎症疾病如动脉粥样硬化、风湿性疾病及艾滋病中发挥重要的调节作用。研究最为透彻的是它在动脉粥样硬化中的作用。大量的研究表明动脉血管内皮细胞可以分泌MCP-1,通过结合单核细胞表面的CCR2受体而对其产生趋化作用,使血液中的单核细胞迁入内膜下,活化为巨噬细胞,吞噬脂质形成泡沫细胞,并最终导致动脉粥样硬。随着研究的不断深入,证实MCP-1/CCR2轴在肿瘤微环境中多种细胞及在肿瘤细胞本身的表达,并且对肿瘤的发生发展起重要的作用。在多种在血管形成过程中,研究发现血管内皮细胞既表达CCR2受体也可分泌MCP-1,且MCP-1可诱导血管内皮细胞的迁移,并且在排除炎症因素影响后证实MCP-1对血管的形成具有直接作用。在前列腺癌中也发现前列腺癌细胞自身存在MCP-1和CCR2的表达,并且CCR2的表达同前列腺癌的进展呈正相关,它在转移性前列腺癌组织的表达高于局灶性前列腺癌及良性前列腺组织。CCR2的高表达同较高的Gleason评分和较高的临床病理分期相关,提示CCR2同前列腺癌的进展相关。并且研究证实MCP-1在前列腺癌中可以通过自分泌/旁分泌循环来促进前列腺癌细胞的增殖和迁移,促进肿瘤的发展。这些都证明了MCP-1/CCR2轴对肿瘤的发生发展起直接作用,这是有别于传统MCP-1通过趋化免疫细胞和间质细胞从而对肿瘤微环境作用促进肿瘤进展的新理论。尽管近来在对MCP-1在大肠癌中的作用的研究越来越多,虽然有报道MCP-1在不典型增生腺瘤表达增高,且同大肠癌的肝转移密切相关,但是尚未有关于MCP-1/CCR2轴在正常黏膜、腺瘤及大肠癌不同进展阶段的完整的“腺瘤-癌变”途径的分析,而且MCP-1作为一种分泌型的蛋白在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌等多种肿瘤患者血清中表达升高,且与肿瘤恶性程度相关,但是在大肠癌中却研究少见,此外,目前尚未见关于MCP-1/CCR2轴对体外大肠癌细胞侵袭能力的影响的研究报道。因此本课题将从MCP-1/CCR2轴在大肠癌正常黏膜、腺瘤、大肠癌的组织表达,MCP-1在大肠癌患者血清表达情况,激活MCP-1/CCR2轴对大肠癌细胞侵袭力的影响等方面进行初步研究,以明确MCP-1/CCR2轴激活后对大肠癌的影响。方法和结果1、主要实验材料及方法1.1组织学及血清学标本收集收集惠州市中心人民医院2003年1月至2005年12月有完整临床病理资料的大肠癌的术后病理组织标本177例,其中男103例,女74例,平均年龄59.0岁；随机选取66例癌旁5-10cm肠黏膜组织作为正常对照,其中男41例,女25例,平均年龄56.5岁；腺瘤组织65例,其中男39例,女26例,平均年龄57.2岁,所有患者术前均未接受放化疗及其他针对肿瘤的特殊治疗,以全国大肠癌协作组病理组规范进行病理诊断、分级和分期。按分化程度分为：高分化腺癌67例,中分化腺癌56例,低分化腺癌与粘液腺癌共同归为低分化组一并统计共54例。按Dukes分期分为：A期21例,B期66例,C期50例,D期40例。收集惠州市中心人民医院2009年7月至2011年6月住院治疗的大肠癌患者的血清66例,54例健康志愿者的血清做正常对照组。大肠癌组66例,男33例,女33例,平均年龄60.0岁,正常对照组54例,男23例,女31例,平均年龄54.9岁。大肠癌患者均经手术治疗且经手术病理确诊。血清采集前均未经手术、化疗、介入等治疗。研究方案经惠州市中心人民医院伦理委员会同意,并且经患者签字同意。1.2免疫组织化学染色应用ABC法检测MCP-1, SP法检测CCR2。样本的连续切片(4μm)经二甲苯脱蜡及梯度乙醇逐步水化后,按照不同SP试剂盒和ABC试剂盒说明书要求操作。抗原修复过程中检测MCP-1采用pH9.0Tris-EDTA水浴加热抗原修复,检测CCR2采用pH6.0枸橼酸钠微波抗原修复,一抗MCP-1(1：50,鼠抗人,购自R&D公司),CCR2(1：400,兔抗人,购自Abeam公司)4℃孵育过夜,均采用DAB显色,镜下掌握显色程度。苏木素复染1min,盐酸酒精分化。脱水、透明、封片、镜检。每次实验均以已知阳性组织切片为阳性对照,以PBS缓冲液代替一抗,做阴性对照。所有结果由一个研究者和一个病理科高级医师独立阅片评分。1.3染色评分不加一抗的组织切片作为阴性对照,已知抗原表达的组织切片作为阳性对照。光镜下观察每例免疫组化染色切片,腺体细胞胞浆出现棕黄色阳性颗粒为阳性细胞,随机观察10个高倍视野,每个视野计数100个腺体细胞,根据阳性细胞比率和染色强度综合评定。①阳性细胞比率评分：0分为阳性细胞数占总细胞数<10%,1分为10%-50%,2分为阳性细胞数占总细胞数50%-75%,3分为阳性细胞数占总细胞数>75%。②组织染色强度评分：0分为无染色,1分为淡黄色,2分为黄色,3分为棕褐黄色。③总分=阳性细胞比率评分×染色强度评分：0分为阴性(-),1～2分为弱阳性(+),3～4分为中度阳性(++),5～6分为强阳性(++)。1.4利用ELISA法检测大肠癌患者血清MCP-1浓度取术前肿瘤患者及健康体检者静脉血,待血液凝固后,1000r/min15min分离血清,置-80℃保存待检。采用美国R&D公司MCP-1ELISA定量检测试剂盒进行测定。严格按照试剂盒要求操作。应用ELISA2.0软件,以标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的四参数拟合曲线方程式,将样品的OD值代入方程式,计算样品浓度。1.5统计学处理应用SPSS13.0软件进行统计学处理,计量资料两组比较采用两样本t检验,多重比较采用oneway-ANOVA; R×C列联表资料采用crosstab检验；等级资料两组比较采用Mann-Whitney U-检验；多组比较采用kruskal-wallis H检验,统计量以mean±SD表示,以P<0.05为差异有统计学意义。1.6利用反转录酶聚合酶链反应法(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测不同大肠癌细胞株MCP-1及CCR2的表达情况LoVo、SW116、HT29、SW620和SW480细胞都是人大肠腺癌细胞株,用含有10%FBS的RPMI-1640完全培养液,5%CO2、37℃、湿度充分条件下常规培养,每周传代两次。按Invitrogen的Trizol的说明书提取细胞总mRNA,使用Invitrogen公司逆转录试剂盒,按说明书将mRNA逆转录为cDNA, PCR扩增MCP-1、CCR2及GADPH目的片段,说明书的PCR体系进行加样,反应条件为：94℃预变性5min,然后进入以下36个循环：94℃变性45s,56℃,退火50s,72℃延伸50s；循环完毕,72℃延伸7min。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。电泳条件为,恒压80v,约30mmin。1.7利用蛋白印迹法(Western Blotting analysis)检测不同大肠癌细胞株MCP-1及CCR2的表达情况细胞长至完全汇合后去除培养基并应用预冷的1×PBS清洗贴壁细胞2次,细胞皿中加入预冷的RIPA细胞裂解液(含有1：100的PMSF),将裂解产物转移到1.5ml离心管中,冰上放置30min,间断震荡5-6次,4℃,20000g,离心25min,取上清液,BCA法测蛋白浓度后,加入SDS上样缓冲液,煮沸5min,于-20℃保存。将蛋白(上样量40μg)加入SDS-PAGE凝胶泳道中(12%分离胶和5%浓缩胶)进行电泳,湿转法将蛋白转移到PVDF膜上,应用TBST(含0.1%吐温-20)配置的5%(w/v)脱脂奶粉室温封闭1h,按抗体说明书要求加入相应浓度的一抗,4℃,摇床震荡过夜；去除一抗后,孵育相应HRP结合的二抗(1：5000),移除二抗,并充分洗涤后,应用ECL发光液进行发光。1.8细胞侵袭实验用DNA重组技术设计合成针对CCR2mRNA序列的siRNA寡核苷酸片段,然后应用阳离子脂质体lipofectamineTM2000转染经筛选为CCR2高表达的LoVo细胞,RT-PCR和Western Blotting检测LoVo细胞中CCR2mRNA蛋白的表达情况以及转染效率,并筛选出效率最高的siRNA进行细胞生物学实验。细胞侵袭实验中将细胞分为四组：(1)空白blank组,即细胞不经转染处理,且下室中不加重组人MCP-1(rhMCP-1)(2)只加rhMCP-1组,即细胞不经转染处理,但是在下室加入rhMCP-1(3) NC组,即细胞转染无关序列干扰片段,下室加入rhMCP-1(4)实验组,即细胞转染CCR2siRNA,下室加入rhMCP-1.Transwell小室购自美国BD公司。小室底部的膜材料为聚碳酸酯膜(ployearbonate, PC),在transwell小室滤膜的上表面铺30μL稀释后的Matrigel,37℃孵育至少4-5h。消化细胞并稀释到1.0×106个/mL浓度备用。小室上室加入无血清细胞悬液200μL,下室加入500gL含10%FBS的1640培养液,放入37℃,5%CO2培养箱中培养。24h后取出transwell小室,轻轻用棉签擦去上室残留的细胞,用PBS洗2遍,4%多聚甲醛固定30min。0.1%结晶紫染色,PBS充分洗涤。显微镜下(200×)随机选取5个视野进行细胞计数。SPSS13.0统计软件进行统计分析。2、结果2.1MCP-1、CCR2在大肠正常组织、腺瘤及腺癌组织的表达呈现逐渐递增的趋势三组患者性别(χ2=0.319,P=0.852)、年龄(F=0.483,P=0.617)无显著差异。MCP-1与CCR2在细胞中的表达部位一致,都为细胞浆表达,且在三组中MCP-1/CCR2的染色分布呈现出由正常、腺瘤到癌变逐渐递增的趋势。其在正常组织的腺细胞中无表达,或仅在少数几个细胞有表达。在腺瘤中其呈现阴性或弱阳性表达,而在腺癌中二者均呈现出显著高表达。这提示MCP-1/CCR2轴与大肠癌的发生发展有密切关系,可能参与经典的大肠癌的“正常黏膜-腺瘤-癌变”过程。2.2MCP-1/CCR2在大肠癌组织中的表达与肿瘤的分级、分期和转移相关MCP-1表达与大肠癌Duke’s分期(χ2=32.047,P=0.000)、分化程度(χ2=16.776,P=0.000)、淋巴结转移(Z=-3.571,P=0.000)及远处转移(Z=-3.863,P=0.000)之间有统计学意义,而与患者年龄(Z=-0.105,P=0.916)、性别(Z=-0.545,P=0.586)、肿瘤发生部位(χ2=0.167,P=0.558)以及肿瘤大小(Z=-0.866,P=0.386)之间无统计学意义。同样的在大肠癌组织中CCR2蛋白表达水平与大肠癌Duke’s分期(χ2=21.732,P=0.000)、分化程度(χ2=9.656,P=0.008)、淋巴结转移(Z=-4.212,P=0.000)及远处转移(Z=-3.326,P=0.001)之间有统计学意义,而与患者年龄(Z=-0.128,P=0.898)、性别(Z=-0.784,P=0.433)、肿瘤发生部位(χ2=0.610,P=0.737)以及肿瘤大小(Z=-0.305,P=0.760)之间无统计学意义。2.3MCP-1和CCR2在大肠癌组织中有不同程度的表达情况,二者的表达呈正相关关系在177例大肠癌组织中的免疫组化染色显示,MCP-1、CCR2在大肠癌组织中有不同程度的染色；MCP-1(-)6.2%,(+)12.4%,(++)36.7%,(+++)44.6%,低表达((-)+(+))组18.6%,高表达组((++)+(+++))81.4%；CCR2(-)4.5%,(+)11.3%,(++)40.7%,(+++)43.5%,低表达((-)+(+))组15.8%,高表达组((++)+(+++))84.2%。组织连续切片提示MCP-1、CCR2的表达有相关性,为了明确MCP-1和CCR2在组织中的关系,应用spearman相关分析提示MCP-1、CCR2的表达呈正相关关系(r=0.485,P<0.01)2.4MCP-1在大肠癌患者的外周血中表达升高大肠癌组与健康对照组之间性别(χ2=0.655,P=0.418)、年龄(χ2=1.919,P=0.057)构成差异无统计学意义。血清MCP-1的浓度测定值经1g变换以满足正态分布,之后全部数据均由此变换数据lgMCP-1计算。lgMCP-1的水平在大肠癌患者组中较正常对照组明显升高(t=5.219,P=0.000),差异有统计学意义。2.51gMCP-1与大肠癌的病理分级和分期相关血清lgMCP-1水平与患者性别(t=-0.642,P=0.523)、年龄(t=-0.456,P=0.656)、肿瘤大小(t=--0.325,P=0.746)、部位(F=0.281,P=0.756)之间差异无统计学意义,而与Duke’s分期(F=16.327,P=0.000)、肿瘤分化程度(F=5.356,P=0.007)、淋巴结转移(t=5.925,P=0.000)及远处转移(t=-4.622,P=0.000)之间有统计学意义。绘制受试者工作特征(ROC)曲线检测lgMCP-1对于诊断大肠癌的敏感性和特异性,当临界值为2.25时,诊断大肠癌的敏感性为62.1%,特异性为64.8%。2.6MCP-1和CCR2在不同大肠癌细胞株间存在差异表达RT-PCR检测发现MCP-1在LoVo细胞呈高表达,在SW480及SW1116为中度表达,在SW620和HT29表现为低表达或无表达；Western blot检测发现MCP-1在LoVo、SW1116高表达,在SW620和HT29中度表达,在SW480低表达。RT-PCR检测发现CCR2在LoVo细胞高表达,在SW480细胞中表达,在SW1116, SW620和HT29呈弱表达或无表达；Western blot检测发现CCR2在LoVo细胞高表达,在SW1116中度表达,在HT29、SW620和SW480则无表达。说明大肠癌细胞株在基因和蛋白水平均存在MCP-1和CCR2的表达,但是不同细胞株之间存在差异表达,在LoVo细胞株两者均呈现高表达。2.7激活MCP-1/CCR2轴可使细胞侵袭能力增强Transwell侵袭实验结果提示,与LoVo细胞相比,加入rhMCP-1的处理组穿膜细胞数增多；与转染NC组(scrambled siRNA+rhMCP-1的处理组)相比,在实验组(CCR2siRNA+rhMCP-1的处理组)中,穿至下室的细胞明显减少,差异具有统计学意义；在四组中在NC组(scrambled siRNA+rhMCP-1的处理组)和只加rhMCP-1组两组,迁移的细胞数量相似数量居中,但是均较空白组明显增多。在无处理的细胞中加入MCP-1可增强细胞侵袭,加入CCR2siRNA沉默CCR2后细胞的侵袭能力下降。说明MCP-1可以增强细胞的侵袭能力,并且在细胞侵袭过程中需要CCR2的参与,CCR2的缺失可导致细胞的侵袭能力下降。结论1、MCP-1/CCR2轴在大肠癌的进展过程中有重要作用,可能参与大肠癌的“正常黏膜-腺瘤-癌变”途径；2、MCP-1/CCR2轴与大肠癌体内侵袭和转移关系密切,两者的相互作用可能是调节大肠癌侵袭转移过程的一种新机制；3、MCP-1/CCR2轴活性与大肠癌细胞体外侵袭能力相关,CCR2缺失可使大肠癌细胞侵袭能力下降。