研究背景和目的：　　 阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)给家庭和社会带来沉重负担，迄今为止还没找到有效的防治方法和药物，国内外科研人员均把开发预防和治疗AD的药物作为一个重大的社会攻关项目。近年来研究表明β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)在AD的病理发生机制中发挥主要作用，设计以Aβ为靶的药物治疗是治疗的重要途径。　　 减少或阻断Aβ在脑内的沉积，可以对AD的病程发展起到有效的治疗作用。Aβ由APP蛋白(β-淀粉样前体蛋白)裂解而来，其中β-分泌酶(BACE1)在APP蛋白的裂解过程中起重要作用，是产生Aβ的关键酶，抑制BACE1的活性，可以达到减少Aβ生成的目的。　　 BACE1目前被普遍认为是最有希望的攻克AD的药物靶点。现在绝大部分BACE1抑制剂的设计还只是基于其作用底物或与其类似的天门冬氨酸蛋白酶抑制剂的骨架结构进行优化，这类抑制剂大多是具有8-9个氨基酸的肽类，难以穿透血脑屏障为脑神经细胞所吸收，生物利用度低。同时肽类化合物稳定性差，易为蛋白酶水解，药效作用时间短。　　 本课题组希望能在短时间内开发出分子量较小、结构简单、选择性高的非肽类BACE1抑制剂，而且能口服吸收有效，无交叉反应，还能通过血脑屏障。为此，本研究采用国际上大型制药公司在早期药物开发阶段所使用的技术，通过计算机高通量虚拟筛选，针对BACE1的二维晶体结构，在计算机工作站上利用分子对接软件筛选ZINC数据库，同时利用先进的线性相互作用能的理论和方法，在非常短的时间进行大规模计算，从上百万个小分子化合物中发现有苗头的化合物，避免了漫长而又昂贵的实验过程，为进一步的药物开发奠定基础。　　 为了验证通过计算机虚拟筛选出的BACE1小分子化合物是否真正对BACE1有抑制作用，本研究采用荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energytransfer，FRET)进行实物检测，FRET技术是目前极受到重视的一门高新技术，非常快速和敏感，在药物开发过程中，FRET技术现已被应用于高通量筛选。　　 本研究的目的有2个，一是构建计算机药物筛选平台，为大规模的药物虚拟筛选提供坚实的基础；二是希望通过计算机虚拟筛选，在短时间内寻找到BACE1的小分子非肽类抑制剂，根据这些活性化合物的结构特点，为新型AD药物的设计与开发提供重要的信息指导。　　 实验一针对BACE1的多种软件测评　　 针对BACE1的三维晶体结构，为了弄清楚采用何种分子对接软件为优，以及具体的参数设置，我们利用已知的含有0.5％阳性分子的数据库，对7套分子对接软件及相关参数设置模拟一个真实的筛选。(1)构建计算机药物筛选平台，将Dock6.0，AutoDock4.0，Ligandfit，Surflex2.1，eHiTS6.2，FlexX，FlexX-Pharm等9套分子对接软件的源代码进行编译，调试；(2)从Prous数据库中选择了50个BACE1抑制剂作为阳性分子，丛WDI数掘库中选择9950个BACE1的阴性分子，将它们混合做成测评用数据库，共有10，000个分子，其中阳性分子占0.5％；(3)利用Dock6.0，AutoDock4.0，Ligandfit，Surflex2.1，eHiTS6.2，GOLD3.0，FlexX和FlexX-Pharm共8套分子对接软件，筛选测评用数据库，采用富集因子(Enrichment Factors，EF％)作为评判各个软件筛选效果的优劣。　　 结果：　　 经计算，发现分子对接软件eHiTS6.2和FlexX-Pharm筛选测评用数掘库的EF％值最高，分别为48％，52％。于是我们采用这两种软件进行下一步的大规模虚拟筛选。　　 实验二大规模虚拟筛选　　 在虚拟筛选过程中，化合物数据库与靶蛋白的选择、筛选前的处理、分子对接软件的选择与参数设置、对接后的分析以及待测化合物的选择购买等等，都需要研究人员的精心设计。(1)为了方便数据库的管理，筛选和购买，本研究将ZINC数据库的460万个小分子导入本地计算机的My SQL数据库平台，同时根据购买信息，本课题研究组利用SQL语言编写了脚本程序，将其中的Sigma公司的8万个小分子抽提出来，组成专门的Sigma数据库以供筛选；(2)采用eHiTS6.2软件对BACE1的25个阳性分子和4475个阴性分子进行神经网络训练，利用此训练集对Si gma公司的8万个小分子进行快速过滤；(3)应用有药效团约束的基于蛋白三维结构的虚拟筛选，采用FlexX-Pharm软件，在筛选前定义活性口袋，质子化状态为Asp32质子化，Asp228离子化；药效团约束设置为Asp32，Asp228，Gly34，Gly230在对接时作为氢键受体。根据一致性打分函数的高低进行排序；(4)采用Liaison4.0软件，应用线性相关作用能的方法和理论计算蛋白和小分子的结合自由能；(5)经计算后，选择符合要求的小分子从sigma公司购买。　　 结果　　 eHiTS成功地过滤了sigma公司的8万个小分子化合物，我们选取了排序前列的1万个分子，进行下一步的FlexX-Pharm软件筛选，选取一致性打分函数全部为5，FlexX打分值在-26以上者，共有200个小分予化合物进行结合自由能计算，经过Liaison计算后，选取liascore分值在-8.0以上者，只有20个，最终从sigma公司购买到13个化合物。　　 实验三应用荧光共振能量转移技术检测化合物对BACE1活性的抑制作用　　 底物肽Rh-EVNLDAEFK-Quencher是BACE1的特异性底物，在BACE1作用下产生的代谢产物在530-545nm荧光的照射激发下，可产生570-590nm的荧光，荧光强度的变化可以灵敏地反应BACE1活性。1)将从Sigma公司购买的13个化合物溶解，每个化合物的浓度调为10μg/mL进行粗筛，发现有抑制效果的化合物后，按600μM，300μM，150μM，75μM，37.5μM，18.5μM，9μM这样7个浓度梯度等比稀释；2)准备3X的BACE1工作液(1.0unit/ml)，3X的底物工作液(750nM)，将底物工作液和各个浓度梯度的化合物工作液加入黑色384孔板中混合，轻微摇晃，每个浓度4个孔；加入3X的BACE1工作液，避光室温孵育1小时；4)在室温下孵育60分钟；5)加入10μl的终止液，终止反应；6)在BIO-TEK荧光分光光度计中读取荧光值，参数设定为激发光：530-545nm，发射光：570-590nm；7)将所有数据导入Prism4.0软件(GraphPadSoftware，Inc)中进行分析，根掘酶活性对照值计算抑制率和IC50值，所有数据均以X±s表示；　　 结果：　　 经荧光共振能量转移技术检验，发现有2个化合物呈现出较高的抑制活性，它们是ZINC02574759，ZINC04787276，其中ZINC02574759的IC50值为91±3.5uM，ZINC04787276的IC50值为73±4.8uM。这2个化合物都是药物类似物，符合Li pinskis五原则，经分子间相互作用及药效团分析，它们可以作为治疗AD的先导化合物，值得进一步研究，有希望将它们发展成为新型的AD药物。　　 小结：　　 为了开发治疗老午痴呆的新药，本课题组采用普通的计算机工作站，成功地构建了计算机药物筛选平台：编译了Dock6.0，AutoDock4.0等多种分子对接软件的源代码，编译了Gromacs3.3，Amber9.0等分予动力学软件的源代码；将ZINC数据库中460万个小分予化合物的三维结构下载到本地计算机，通过MySQL数据库进行管理，检索和查询，而且将ZINC数据库中sigma公司的小分予化合物的三维结构抽提出来，做成sigma数据库，共有8万个小分子化合物，极大的方便了虚拟筛选和购买；　　 通过软件测评，本研究选用eHiTS软件和FlexX-Pharm软件进行下一步大规模虚拟筛选。首先用eHiTS软件进行神经网络训练，快速过滤sigma数据库8万个小分子化合物，确定了1万个化合物；采用FlexX-Pharm软件进行有药效团约束的基于蛋白结构的虚拟筛选，从1万个化合物中确定了200个化合物；采用Liai son软件，对200个化合物进行线性相关作用能计算它们与BACE1的结合自由能，确定了13个分子购买；　　 本研究采用荧光共振能量转移技术测试购买的化合物是否有对BACE1有抑制作用，发现了新型的BACE1抑制剂ZINC02574759和ZINC04787276，它们可以作为先到化合物，通过化学修饰，有望将它们开发为新型的AD药物。　　 本研究表明，在药物开发的早期阶段，将计算机虚拟筛选技术和荧光共振能量转移技术相结合，可以省钱和省时，而且同高通量筛选一样有效。