第一部分结核特异蛋白的原核表达、纯化和抗结核单克隆特异抗体的制备目的利用已构建的基因原核表达重组质粒,表达和纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)分泌蛋白Ag85B和ESAT-6;利用已分离的杂交瘤细胞,制备和纯化抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体。材料与方法1.扩增培养含重组质粒(pET-30a-85B和pET-30a-ESAT6)的表达细菌,收集和裂解细菌,提取重组质粒,进行质粒DNA聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)和酶切鉴定,诱导表达85B和ESA-6蛋白,将诱导的表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,并纯化蛋白作为抗原,定量备用。2.利用杂交瘤技术分离得到的,针对MTB85B和ESAT-6抗原的杂交瘤细胞(2H4和1B103)株,通过免疫印迹(Western blot)法确认,进行细胞培养,以制备抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体(Monoclonal antibody, MAb),二氧化硅吸附法纯化腹水型单抗。3.采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)鉴定经提取重组质粒诱导表达的85B和ESAT-6蛋白,与采用杂交瘤技术获得的抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体之间的结合活性。结果1.PCR扩增和重组质粒酶切鉴定结果证实Ag85B和ESAT-6蛋白被成功表达。37℃诱导后为包涵体,通过降低诱导温度而为可溶性表达。纯化后85B和ESAT-6蛋白浓度分别为8.31mg/mL和2.5mg/mL. SDS-PAGE结果显示纯度在95%以上,可用来做抗体效价测定。2.分别获得腹水型单克隆抗体2mg, SDS-PAGE结果显示纯度在95%以上,满足后续对比剂标记所需的量。3. ELISA结果显示制备的抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体可与MTB85B和ESAT-6抗原发生特异反应。抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体纯度高,血清效价大于1：625000。结论1.MTB的分泌蛋白Ag85B和ESAT-6被成功表达、纯化,并具有良好的免疫原性,为进一步评价单克隆抗体的效价提供靶抗原。2.制得抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体,检测抗体效价高,为制备本研究中所需的靶向对比剂提供实验材料。第二部分抗结核单克隆抗体靶向CT对比剂的研制目的对抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体进行碘标记,使其耦联,探讨靶向CT对比剂的制备可行性及体外生物学活性。材料与方法1.生物素—亲和素系统(Biotin-avidin system, BAS)的放大作用研究以牛血清白蛋白代替抗体,采用Iodogen法分别对牛血清白蛋白进行直接标记以及对BAS化的牛血清白蛋白进行间接放射性碘标记,初步建立其碘标效率的测定方法,并比较直接标记法和利用BAS间接标记法的碘标效率,为优化靶向CT对比剂的制备条件提供评价依据。2.*I-抗鼠单克隆抗体的制备(1)采用氯甘脲(商品名Iodogen)标记法,以放射性碘(Na125I)示踪非放射性碘(Na127I)分别标记抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体,并以硅胶纸层析法测定其标记率,计算碘结合量,分离纯化测定放化纯度,并考察其稳定性。(2)以*I-抗85B抗体为例,观察不同Na127I投料量、不同Iodogen投料量、不同批次Iodogen反应管对标记的影响,优化碘标记的制备条件。(3)利用间接ELISA法测定抗鼠单克隆抗体碘标后与结核抗原的结合能力,与同阴性对照OD (Optical density, OD)值相比,大于等于2.1倍者为阳性。3.抗鼠单克隆抗体CT对比剂的制备经Iodogen法引入非放射性碘(Na127I)分别标记抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体,采用小样标记、纯化,并计算所制备对比剂溶液中的抗体量和含碘量。结果1.生物素—亲和素系统(BAS)的放大作用实验显示直接标记牛血清白蛋白,其碘与蛋白的摩尔比(mol/mol)达6.372,而采用间接标记法标记的摩尔比仅为0.617。2.*I-抗鼠单克隆抗体的制备(1)碘标抗85B抗体的标记率为(86.25±6.34)%,放化纯度>98%；经纯化后,蛋白回收率(82.95±4.17)%。在体外4℃条件下存放一周后放化纯度>93%。(2)碘标抗ESAT-6抗体的标记率为(83.07±2.05)%,放化纯度>98%；纯化后,蛋白回收率为(36.75±12.80)%。置于4℃条件下,于1天和7天后测定其放化纯度,均>95%。(3)以*I-抗85B抗体为例,当Na127I(0.4μg/μL)投料量分别为5μL20μL、20μL时,标记率分别为89%、95%、70%；当标记率为95%时每毫克抗85B抗体含有127I64.3μg。计算含Iodogen200μg、100μg、50μg反应管中,标记率分别为70%、95%、93%。测定不同批次(分别制备于2010-2-25；2010-3-23;2010-3-29；2010-3-31)的Iodogen反应管,标记率分别为95%、86%、80%、84%。(4)间接ELISA法检测,结果显示非放射性碘(Na127I)标记抗85B和ESAT-6抗体与结核抗原仍保持较好的结合能力。3.抗鼠单克隆抗体CT对比剂的制备(1)纯化的127I-抗85B鼠单克隆抗体洗出液共2.52mL；该对比剂溶液中含抗85B抗体质量为：210～255μg；含有1271质量为：10.5-16.6μg。(2)纯化的127I-抗ESAT-6鼠单克隆抗体收集液共2.93mL,该对比剂溶液中的抗体量和含碘量分别为：147μg和20.58μg。结论1.以*I-抗85B抗体为例,*I-抗鼠单克隆抗体的最佳标记条件为Iodogen100μg, Na125I150μCi,Na127I4μg抗体50μg,室温条件下反应5min,标记率达85%以上,放化纯度>98%,并且稳定性好。2.初步制备127I-抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体靶向CT对比剂,具有较好的体外稳定性和生物学活性。第三部分结核靶向CT对比剂在结核动物模型中的初步观察一结核急性感染动物模型的建立及其综合评价目的建立小鼠急性感染MTB的动物模型。材料与方法1.采用尾静脉注射和滴鼻方式将结核分枝杆菌H37Rv标准株菌悬液接种至C57BL/6J小鼠体内,随机分为尾静脉注射高、中、低剂量组和滴鼻感染组各20只,尾静脉和滴鼻对照组各5只,比较不同感染途径和接种菌量对建模的影响。2.在小鼠感染后第4周、6周和8周分别行胸部Micro-CT扫描,观察动物模型的肺部表现,对图像质量进行评分。3.扫描完成后无菌分离小鼠肺脏,行HE染色、抗酸染色、PAS染色、CD68免疫组化检测和菌落计数,观察MTB在体内的定值等。结果1.Micro-CT扫描和肉眼观察发现,小鼠肺部感染情况随感染时间延长而逐渐加重,至感染后第6周开始肺部病变明显,第8周时病变可弥漫全肺。滴鼻组Micro-CT扫描阳性率高,且对病灶显示的评分高。2.肺组织切片HE染色显示各感染组肺组织有不同程度的炎性改变。随着接种菌量的增加,组织病理改变越显著,滴鼻感染组较尾静脉各剂量组明显,抗酸染色可见红染短小的结核分枝杆菌。3.两种方式感染小鼠,肺组织病理学结果和活菌计数均表明成功建立了小鼠急性感染结核病动物模型,感染106cfu/mL菌量可以较好的作为模型感染剂量；菌落计数显示各感染组之间无显著性差异(P>0.05)。接种菌量一致的情况下,滴鼻组肺组织病理改变较尾静脉感染组显著。结论1.尾静脉注射和滴鼻法均可成功建立小鼠急性结核病感染模型。但滴鼻法建立C57BL/6J小鼠急性感染肺结核动物模型简单方便,成模率高。小鼠对实验操作耐受性好,是较为理想的影像学研究动物模型。2.Micro-CT扫描对结核动物模型肺部病变敏感,与病理结果相关性高,可作为活体动物模型的评价指标之一。二靶向CT对比剂在结核急性感染动物模型中的初步观察目的探讨抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体靶向CT对比剂对小鼠急性感染肺结核动物模型显示的可行性。材料与方法1.采用已纯化的抗85B和ESAT-6鼠单克隆抗体与碘原子偶联制备靶向CT对比剂,计算对比剂溶液中抗体含量和结合127I含量,稀释后配制成5μgI/ml备用。2.将20只小鼠急性感染肺结核动物模型,分为靶向对比剂组(10只)、普通对比剂组(5只)和空白对照组；其中靶向对比剂组根据注射对比剂成分的不同,又分为85B组和ESAT-6组(每组各5只)；普通对比剂组注射相同含碘浓度的碘海醇稀释液；空白对照组注射PBS(抗体稀释液)。分别于注射对比剂前、注射对比剂后(即刻、6h、12h、24h)不同时间行Micro-CT扫描,观察小鼠肺内病变的显示情况。结果1.实验所制备的2.52mL抗85B对比剂溶液中含有210～255μg抗体,10.5～16.6μg127I;2.93mL抗ESAT-6对比剂溶液中含有抗体147μg,结合的127I约20.58μg。2.对照组小鼠肺内病变在注射PBS前后,均未见强化。靶向对比剂组小鼠肺内病变的CT值随时间延长而逐渐升高,在注射对比剂后12h病变强化明显,在注射对比剂24h后肺内病变仍有强化,且与普通对比剂组小鼠肺内病变的CT值相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.制备的抗85B和ESAT-6结核特异抗体靶向CT对比剂在小鼠肺结核动物模型中具有一定靶向性。2.对靶向对比剂注射剂量,Micro-CT扫描时间,和对比剂注射后时间强化曲线的探讨,为结核相关靶向对比剂的研究提供了实验依据。