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杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD; OMIM310200)是一种神经肌肉系统常见的X-连锁隐性遗传病,主要累及男婴,在存活男婴中发病率约1/3500～1/6000,其主要临床特征为缓慢进行性加重的对称性肌肉无力和萎缩,患者多起病于3-5岁,出现走路姿势异常、易跌倒、肌无力等症状,12岁前丧失站立和行走能力,20岁左右死于呼吸困难、心力衰竭。本病是由位于Xp21.2的dystrophin基因突变导致,该基因全长约2.4Mb,约占X染色体全长的1.5%,是目前人类已发现的最大基因,其cDNA全长13974bp,共有79个外显子,其编码一种相对分子质量为32万道尔顿的肌养蛋白。近65%患者由一个或多个dystrophin基因外显子的缺失所致,5%由重复突变导致,30%由点突变导致。胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation genetic diagnosis, PGD)可通过筛选正常的胚胎移植,以防止遗传学异常妊娠的发生,避免了反复流产、引产对孕妇及其家庭造成的伤害。目前已有DMD-PGD相关报道,多重巢式PCR、连锁分析、限制性酶切等方法都在其PGD考虑之中,但这些方法仅限于对单细胞几个位点进行直接扩增,有位点少、扩增效率低、不能重复、条件要求高等缺点。对于临床PGD十分不利,因此全基因组扩增将模板量大幅提高,避免上述问题的产生。目前全基因组扩增已发展出引物延伸预扩增(Primer extension preamplification, PEP)技术和简并寡核苷酸引物PCR (Degenerate oligonucleotide primed-polymerase chainreaction, DOP-PCR)技术及多重置换扩增技术(multiple displacement amplification, MDA)。MDA技术已成为目前最有发展前景的WGA技术。目的：本研究通过使用多重巢式PCR和MDA的全基因组扩增技术对4个DMD家系完成PGD预实验,在实验中优化DMD-PGD预实验流程,并对多重巢式PCR和MDA-WGA方法对单细胞的扩增效率及诊断准确率和ADO发生率进行评估,对DMD-PGD中现有的10个STR位点进行有效率评价,最后对其中存在的问题进行讨论分析。材料：本研究材料来自4个家系中患者或(和)其直系亲属,患者及相关成员外周血标本于我院遗传中心抽取,并进行抽提gDNA和分离单淋巴细胞。家系Ⅰ：分子编号M13742,家系中女性携带者年龄34岁,生育一患儿,基因诊断提示女性携带者的dystrophin基因第12-16号外显子杂合缺失；家系Ⅱ：分子编号M5841,家系中女性携带者年龄41岁,生育一患儿,基因诊断提示女性携带者的dystrophin基因存在C.7705C>T杂合无义突变,并曾经行连锁分析；家系Ⅲ：分子编号M13501,家系中女性携带者年龄41岁,生育一患儿,14岁夭折,但未保留样本,基因诊断提示女性携带者的dystrophin基因存在c.6318G>A杂合无义突变,取女性携带者及其父母血样；家系Ⅳ：分子编号M13691,家系中仅有患儿,为新发生突变,基因诊断提示患儿的dystrophin基因存在第48-52号外显子缺失,其母亲则未见异常,年龄40岁。方法：1、制备单个淋巴细胞和抽提外周血gDNA2、家系gDNA水平PCR扩增和荧光-PCR扩增,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光电泳对DMD-STR位点2CA、5CA、7CA、4CA、45CA、49CA、50CA、59CA、63CA、79CA进行连锁分析,确定能提供连锁信息的位点。3、单个淋巴细胞通过多重巢式PCR或MDA-WGA进行初级扩增4、多重巢式PCR初级扩增产物和MDA纯化产物各位点的荧光PCR的扩增5、通过测序仪荧光电泳对荧光PCR产物进行分析及通过琼脂糖凝胶电泳对缺失位点普通PCR产物进行分析6、对需要测序的PCR产物进行回收、纯化及测序分析结果：1、单体型分析结果家系Ⅰ单体型分析结果,能提供连锁信息位点共4个,分别为5CA、44CA、45CA、50CA;家系Ⅱ单体型分析结果,能提供连锁信息位点共3个,分别为44CA、49CA、50CA;家系Ⅲ单体型分析结果,能提供连锁信息位点共4个,分别为7CA、44CA、50CA、63CA;家系Ⅳ单体型分析结果,能提供连锁信息位点共6个,分别为2CA、5CA、44CA、45CA、59CA、63CA。2、各家系单淋巴细胞扩增效率及ADO率家系Ⅰ共完成184个位点的扩增,扩增成功及诊断准确率99.5%(183/184)、ADO率为0,家系Ⅱ共完成153个位点的扩增,扩增成功及诊断准确率为99.3%(152/153)、ADO率为0,家系Ⅲ共完成180个位点的扩增,扩增成功及诊断准确率为100%(180/180)、ADO率为1.1%(178/180),家系Ⅳ共完成480个位点的扩增,扩增成功及诊断准确率为99.8%(479/480)、ADO率为0。3、多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的扩增效率及ADO率比较运用多重巢式PCR扩增方案总共扩增产物337个,扩增成功及诊断准确率为99.4%(335/337),ADO率为0(0/335)；运用MDA-WGA方案总共扩增产物660个,扩增成功率为99.8%(659/660),ADO率为0.3%(2/659)。经χ2检验,两者扩增成功率P>0.05差异无统计学意义,ADO率P>0.05,无统计学意义。结论：1、本实验共完成了4家DMD家系的PGD预实验,单细胞多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的各位点扩增成功率均>90%,ADO率均<10%,达到临床PGD要求,能够应用于临床PGD,这为DMD患者的临床PGD的开展提供了强有力的技术支撑。2、虽然多重巢式PCR方案和MDA-WGA方案的扩增成功率和ADO率无统计学差异。但MDA-WGA在多位点分析上更有优势,这样能更有效地提高单细胞诊断DMD的准确率。3、多位点连锁分析不仅能监测污染的发生,同时也能完成PGD诊断分析,拓宽了PGD的诊断范围,增加了PGD诊断的准确性,降低了误诊的发生。