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手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种严重危害婴幼儿健康的重要传染病,主要由肠道病毒感染引起。流行病学研究证实,引起婴幼儿手足口的肠道病毒主要包括肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)和柯萨奇病毒A16(coxsackievirus A16,CA16)两种亚型。两种亚型毒株同时感染可能诱发严重的并发症甚至死亡。EV71和CA16共存在或共感染时可导致重组毒株出现,引起爆发流行,是严重的公共卫生问题之一。因此,研制抗EV71和CA16疫苗对于有效防控HFMD疫情的暴发流行至关重要。近年来,病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗因其展示抗原和安全性高等优点成为新型疫苗的发展方向之一,人乳头瘤病毒和乙肝病毒等的病毒样颗粒疫苗已成功上市。嵌合多抗原表位的VLPs疫苗研发正在取得积极进展。本论文基于乙型肝炎病毒核心(HBc)的自组装能力,制备了以HBc为载体蛋白展示了 EV71和CA16的多个保守抗原表位的嵌合病毒样颗粒(VLPs)。以小鼠为模型,对VLPs的免疫原性、抗EV71或CA16感染的保护进行评价;基于EV71 P1和3CD在杆状病毒表达系统中共表达可自主切割包装成病毒样颗粒,设计了一种新型重组嵌合肠病毒VLPs,分别将CA16的单个或多个主要抗原表位替换EV71对应区域,研究了EV71和CA16抗原表位的嵌合表达及对VLPs自组装特性的影响,后续将评价嵌合VLPs诱导的抗EV71和CA16感染的免疫保护。主要研究结果包括:1.以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白(tHBc)为载体蛋白,将EV71的保守抗原表位SP70和CA16 VP1蛋白保守中和表位PEP91融合片段插入HBc肽段的Asn75与Ser81残基之间,获得了融合片段tHBc/SP;然后将EV71编码VP2蛋白的CD4+ T细胞优势抗原表位A3融合在tHBc/SP的C端,获得了融合片段tHBc/SPA;以未插入外源基因的tHBc作为对照,将tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc三种基因片段分别克隆到大肠杆菌表达载体pET28中,构建重组表达质粒ptHBc/SP、ptHBc/SPA和ptHBc。转化大肠杆菌,筛选用于病毒样颗粒疫苗生产的工程菌株;经优化条件,高效表达了融合蛋白tHBc/SP、tHBc/SPA和tHBc。通过分离变性包涵体、亲和层析纯化融合蛋白和体外复性等实验,制备了高纯度的VLPs。2.以BALB/c小鼠为动物模型,对两种嵌合病毒样颗粒tHBc/SPA和tHBc/SP诱导的免疫应答和抗病毒感染免疫效力进行评估。结果显示,tHBc/SPA和tHBc/SP两种VLPs免疫小鼠均可诱导针对EV71和CA16的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。与灭活EV71相比,嵌合VLPs诱导Th1细胞因子显着升高,Th2细胞因子降低。用嵌合VLPs免疫母鼠诱导针对子代新生小鼠抗EV71致死感染的完全免疫保护效应和抗CA16致死感染的部分保护。共表达CD4+ T细胞表位没能提高嵌合VLPs在小鼠中的抗病毒效力。3.对杆状病毒表达系统进行优化改造,将巨细胞病毒(CMV)的启动子替换转移质粒pFBDM中的p10启动子驱动3CD基因、降低3CD的表达,减少p10控制3CD表达时与pH启动子驱动的P1表达存在的竞争以提高VLPs产量,获得重组转移质粒pFBDM P1-C3CD。将CA16 SP70单独替换EV71对应片段,构建重组转移pFBDM P1/SP70-C3CD;通过将CA16-SP70、VP2136-150、VP3176-190和VP448-62 同时替换EV71 相应片段,构建重组转移质粒pFBDM P1/4M-C3CD。转化宿主大肠杆菌DH1OMultiBac使四种重组转移质粒发生转座,提取同源重组产生的杆状病毒基因组Bacmid,分别转染昆虫细胞Sf9拯救重组杆状病毒 BacP1-C3CD、BacP1/SP70-C3CD 和 BacP1/4M-C3CD。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组嵌合目的均高效表达;利用昆虫细胞大量培养和重组病毒接种,表达目的蛋白,经过超速离心、凝胶过滤层析和超滤纯化浓缩,制备了高纯度组分。经电镜观察三种重组杆状病毒感染Sf9细胞均生产VLPs。后续将进行嵌合VLPs疫苗的抗EV71和CA16致死感染的免疫效力评价。我们的研究成果为研制抗EV71和CA16感染的VLPs的新型疫苗奠定了重要基础。