微生物转化法制备雄甾-4-烯-3,17-二酮羟化产物的研究

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微生物转化甾体化合物的反应具有污染小、高效、专一性强的优点,其中羟化反应是最重要的反应。雄甾-4-烯-3,17-二酮(1,简称雄烯二酮或4-AD)是合成利尿剂、避孕药、雄激素等甾体药物的重要中间体,其中通过微生物转化法生成的11α-羟基雄烯二酮(11α-OH-4-AD)是合成治疗心血管疾病的药物依普利酮的关键中间体。微生物转化法获得11α-OH-4-AD不仅是半化学合成相应甾体药物的首要攻克目标,而且也是半合成过程中的最关键步骤之一。本论文以4-AD为底物进行了菌种的筛选和转化工艺的优化,以期得到具有一定工业应用价值的菌种。另外,本论文还研究了泡盛曲霉对雄二烯二酮(ADD)的转化过程。详细的研究内容如下:1.从全国不同地方采集的15种土样中获得3株对4-AD有较强转化能力的菌株,分别编号为MH-14、MH-18、MH-19。其中MH-18能够转化4-AD得到11α-OH-4-AD,其基础收率为48.50%,通过形态学观察和菌株分子生物学方面的基因序列比对,最终确定该菌株为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。2.研究了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)对甾体底物雄二烯二酮(ADD)的转化作用。3.测定了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的生长曲线,确定了底物4-AD的最佳投入时间为48 h;通过研究不同培养条件和转化条件对目标产物11α-OH-4-AD转化率的影响,最终确定了最佳培养条件:糊精33.6 mg/mL,玉米粉10.5 mg/mL,磷酸二氢钾1.2 mg/m L,初始pH为4.5;最佳转化条件:温度为32℃,转速为200 r/min,装液量为100 mL/500 mL锥形瓶,底物溶剂为氯仿,底物浓度为1 g/L,转化反应时间为96 h,在上述工艺优化条件的基础上,11α-OH-4-AD的转化率可达到84.02%,比未优化之前提高了35.52%,比已有文献报道的76.48%提高了7.54%。本论文首次研究了MH-14、泡盛曲霉MH-18、MH-19对4-AD及ADD的转化过程,共得8个转化产物,通过分析每一个转化产物的IR,1H NMR,13C NMR,HRMS的图谱并对比相关的文献报道,最终确证转化产物的结构。同时,本研究发现了具有高效11α-羟化4-AD能力的菌株泡盛曲霉MH-18,不仅丰富了微生物转化法制备合成依普利酮的关键中间体11α-OH-4-AD的研究内容,而且也为研发其他的甾体药物奠定了基础。
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