论文部分内容阅读
白色脂肪细胞的过度肥大和增殖,是导致肥胖及其相关代谢疾病的病理基础。通过白色脂肪细胞棕色化将白色脂肪细胞转变成米色脂肪细胞,由主司储能转变为产热的特性,是防治超重和肥胖症的策略之一。本实验室既往研究表明,抑制胰岛素-PI3K-AKT信号通路不仅可显著抑制人和小鼠白色前脂肪细胞成脂分化,促进白色成熟脂肪细胞去分化,还可显著抑制人和小鼠前脂肪细胞棕色化成脂。国内外研究发现,自噬在白色前脂肪细胞成脂分化及去分化过程中起着重要的调控作用,且自噬同成脂分化的关键连接点是mTOR。那么,自噬在白色前脂肪细胞棕色化过程中又起到怎样的调控作用呢?我们假设:自噬参与并通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调控白色前脂肪细胞棕色化。为验证此假设,我们设计以下实验,以期初步明确自噬调控白色前脂肪细胞棕色化的分子机制。本文选用3T3-L1小鼠成纤维细胞系为实验材料,采用“棕色鸡尾酒法”诱导其棕色化成脂分化,共诱导8天,同时使用不同药物进行干预,共设置7组,分别为未诱导组(只添加完全生长培养基CGM)、单纯棕色化诱导组(只添加棕色化诱导培养基CBIM))、棕色化诱导并胰岛素信号抑制组(CBIM+OSI-906)、自噬促进组(CBIM+Rapa)、自噬抑制组(CBIM+Baf-A1)、胰岛素信号抑制并自噬促进组(CBIM+OSI-906+Rapa)及胰岛素信号抑制并自噬抑制组(CBIM+OSI-906+Baf-A1)。细胞于BD0(BD:棕色化诱导天数)开始诱导,持续诱导8天(BD8)。通过分子生物学和形态学检测手段,在转录及翻译水平上检测棕色化相关分子、成脂关键分子、自噬标记分子及胰岛素信号通路关键分子的变化,初步探讨自噬、胰岛素信号、棕色化成脂三者间的互作机制。实验结果如下。1.持续抑制3T3-L1前脂肪细胞胰岛素信号(添加OSI-906),结果显示:虽有部分细胞成脂,但其成脂率远低于单纯棕色化诱导(非胰岛素信号抑制)组,且成脂进程较为缓慢;胰岛素信号关键分子AKT、棕色化标志分子UCP1、PGC1α及成脂相关分子PPARγ、C/EBPβ的表达水平均显著下调,但与未诱导组相比仍保持20.55±2.35%的表达,而另一条棕色化信号通路AMPK-SIRT1中关键分子AMPK、SIRT1的表达水平也有所增加。这些结果表明,抑制胰岛素-PI3K-AKT信号通路可明显降低棕色化成脂,但可通过AMPK-SIRT1信号通路代偿性地维持一定水平的棕色化,这与本实验室既往的研究结果一致,证明胰岛素信号主要通过PI3K-AKT信号通路调控3T3-L1前脂肪细胞的棕色化。2.在3T3-L1细胞棕色化成脂诱导过程中持续促进自噬后,可延迟棕色化成脂进程,并显著降低成脂率,显著促进自噬相关基因(LC3、Beclin1)及SIRT1的表达;相反,抑制自噬则可以在提高成脂率的同时加快成脂进程;然而,抑制mTOR、棕色化相关基因及成脂分子表达水平;自噬抑制组显著促进mTOR、棕色化相关基因(UCP1、PGC1α)及成脂分子(PPARγ、C/EBPβ)的表达,而自噬相关基因的表达水平同单纯棕色化诱导组相比无明显差异。上述结果表明,促进自噬会抑制胰岛素信号下游分子mTOR的表达,其后者通过反馈调节抑制胰岛素信号进而抑制棕色化成脂分化,相反,抑制自噬会促进mTOR的表达,进而促进棕色化水平及成脂进程。3.在抑制3T3-L1胰岛素信号的情况下,促进及抑制自噬干预3T3-L1棕色化成脂分化,其形态显示:同胰岛素信号抑制组相比,胰岛素抑制自噬促进组其成脂率更低,几乎不成脂,而胰岛素抑制自噬促进组,其成脂率有所增加,且加快了成脂进程;转录及翻译水平检测结果显示:胰岛素信号抑制组显著抑制mTOR、AKT的表达,而自噬标记基因(LC3、Beclin1)的表达水平却显著上调,同胰岛素信号抑制组相比,胰岛素抑制自噬促进组显著促进自噬标记分子(LC3、Beclin1)的表达,mTOR、AKT、棕色化相关基因(UCP1、PGC1α)及成脂相关分子(PPARγ、C/EBPβ)的表达水平均显著下调,而AMPK、SIRT1表达得到促进;不同于胰岛素抑制自噬促进组,胰岛素抑制自噬抑制组自噬标记分子(LC3、Beclin1)的表达水平无显著差异,但mTOR、AKT、棕色化相关分子(UCP1、PGC1α)及成脂分子(PPARγ、C/EBPβ)表达水平显著上调。这表明,抑制胰岛素信号后通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路促进自噬,并通过mTOR反馈调节抑制棕色化成脂进程及棕色化水平。在抑制胰岛素信号后促进自噬,通过促进AMPK的表达进一步抑制mTOR,从而进一步抑制棕色化并通过AMPK-SIRT1信号通路使棕色化维持在极低的水平,表现在形态上几乎不成脂。同样在抑制胰岛素信号后抑制自噬会降低AMPK的表达,进而使mTOR表达水平上调,减弱胰岛素信号抑制作用,从而在一定程度上提高棕色化水平。综上所述,自噬通过PI3K-AKT-mTOR信号通路在3T3-L1小鼠成纤维细胞棕色化成脂分化过程中起到了关键的调控作用,其可能的分子机制为:自噬同胰岛素信号的重要连接点是mTORC1,当其受到抑制后,一方面会激活自噬,自噬激活后会通过ULK1促进AMPK的表达,进一步抑制mTORC1,通过AMPK/SIRT1信号通路代偿性地维持棕色化水平;另一方面,通过直接抑制PGC1α或通过PI3K-AKT-mTOR信号通路反馈调节抑制AKT的磷酸化,进而无法使PGC1α、PPARγ、C/EBPβ及PRDM16形成转录复合体,进而抑制UCP1的表达,从而抑制棕色化。