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目的:1.研究新型非苯醌类格尔德霉素衍生物DHQ3和17-DR对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及死亡的影响。2.探寻DHQ3和17-DR诱导的乳腺癌细胞死亡形式及其关键性蛋白表达的影响。3.探寻DHQ3和17-DR对于热休克蛋白90(Hsp90)的客户蛋白表达的影响。4.探寻DHQ3和17-DR在体内是否具有抗肿瘤作用。方法:1.MTT法检测DHQ3和17-DR对人乳腺癌细胞MDA-MB-231存活率的影响。2.集落形成实验检测DHQ3和17-DR对细胞集落形成的影响。3.PI单染法检测DHQ3和17-DR对MDA-MB-231细胞死亡率的影响。4.Annexin V-FITC/PI双染法检测DHQ3和17-DR作用MDA-MB-231细胞24 h后对细胞死亡率的影响。5.DAPI染色法观察DHQ3和17-DR作用在MDA-MB-231细胞后细胞核的改变。6.ATP检测试剂盒检测不同浓度DHQ3和17-DR处理MDA-MB-231细胞后细胞内ATP水平。7.电镜实验观察药物处理细胞后细胞亚显微结构的变化。8.免疫印迹法检测坏死性凋亡相关蛋白、凋亡相关蛋白、Hsp90相关客户蛋白表达的变化。9.免疫荧光法检测DHQ3/17-DR处理MDA-MB-231细胞后坏死性凋亡相关蛋白的定位变化。10.使用si RNA下调MDA-MB-231细胞中RIP1、RIP3的表达后,检测药物对细胞的增殖抑制作用。11.使用Malachite green法检测DHQ3和17-DR的Hsp90 ATPase活性。12.通过肿瘤动物模型观察药物的体内抗肿瘤作用。结果:1.DHQ3和17-DR降低MDA-MB-231细胞的存活率结果显示:MDA-MB-231的细胞存活率和DHQ3和17-DR作用浓度、作用时间均呈负相关关系,即DHQ3和17-DR对MDA-MB-231的增殖抑制逐渐增强。与此同时,细胞数量逐渐减少,且渐趋于变圆。选用低于细胞IC50的药物浓度作用于细胞时,集落形成明显减少。2.DHQ3和17-DR诱导MDA-MB-231细胞发生不同的死亡形式结果显示:随着药物作用浓度的提高,细胞死亡率增加;细胞核逐渐浓染,伴随着核碎裂的发生;细胞内ATP生成逐渐被抑制。电镜下观察到,DHQ3作用后的细胞呈现了细胞核凝聚、线粒体肿胀、细胞内容物外泄等坏死性凋亡的特征;17-DR作用后的细胞呈现细胞核皱缩、染色质边聚等凋亡的特征。3.17-DR诱导MDA-MB-231细胞发生伴随caspase激活的凋亡17-DR作用于细胞后,Mcl-1、Bcl-2表达明显降低,Bax表达显著升高;caspase-8、caspase-3、PARP均发生了明显的剪切。与广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk联用后,17-DR对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用被保护。4.DHQ3诱导MDA-MB-231细胞发生坏死性凋亡DHQ3作用细胞后,结果显示:DHQ3不能诱发caspase-3和caspase-8发生剪切,坏死性凋亡相关蛋白RIP1、RIP3、MLKL表达显著升高。坏死性凋亡特异性抑制剂Nec-1与其联用时,DHQ3对MDA-MB-231的增殖抑制作用明显被保护。5.si RNA特异性地下调RIP1和RIP3实验进一步证明DHQ3诱导发生坏死性凋亡使用有效序列下调RIP1和RIP3后,DHQ3对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用被部分保护,Nec-1对其的保护作用消失。6.DHQ3和17-DR降低细胞内Hsp90客户蛋白的表达结果证明:DHQ3和17-DR的ATPase活性优于格尔德霉素;MDA-MB-231细胞内Hsp90客户蛋白的表达在DHQ3和17-DR作用后逐渐降低。蛋白酶体抑制剂MG132与其联用后,DHQ3和17-DR对于客户蛋白的影响减弱。7.DHQ3和17-DR在体内实验中具有良好的抗肿瘤作用肿瘤动物模型建立后,将其分为4组,DMSO组、DHQ3组、17-DR组、顺铂(DDP)组。实验结果显示:DHQ3和17-DR能够显著降低裸鼠体内肿瘤细胞的增长,且对肝肾的损伤较小。8.DHQ3和17-DR诱导细胞发生不同死亡形式在其他肿瘤细胞中并未出现将DHQ3与17-DR分别与Nec-1联合作用在多种肿瘤细胞上,同样的情况在乳腺癌细胞上出现,而在其他肿瘤细胞上并未发现,具体机制将有待进一步研究。结论:1.DHQ3和17-DR能够抑制人乳腺癌细胞的增殖。2.DHQ3和17-DR诱导MDA-MB-231细胞发生不同的死亡形式。3.DHQ3和17-DR可以下调Hsp90客户蛋白的表达。4.DHQ3和17-DR具有良好的体内抗肿瘤作用。