本研究通过已获得的紫花苜蓿细胞质雄性不育系材料MS-GN-1A和优秀恢复系材料MS178为亲本,经杂交、强迫自交等培育,构建了F2和F1两个群体。通过调查和分析F2群体与F1群体每一株植株的育性,确定紫花苜蓿CMS育性恢复基因的遗传模式;利用简单重复序列(SSR)并结合群体分离分析法(BSA),对两个群体植株材料进行试验分析,进而筛选出与恢复基因Rf连锁的分子标记,并对Rf进行遗传定位。取得的实验结果如下:(1)本研究使用紫花苜蓿不育系MS-GN-1A为母本,恢复系MS178为父本做组合构建BSA分离群体,所获得的F1代均表现为雄性可育,花粉可育率为100%,F2代分离群体在开花期镜检发现全部变为不育和可育类型;F2分离群体共有221个单株,经镜检其中不育株数57,可育为164株,未发现半不育株,可育和不育的分离比例符合3:1的比例。属于典型的单基因控制的孢子体不育。(2)以育性镜检结果作为依据,将分离群体分成两组,可育和不育组。分别提取可育和不育两组的基因组DNA,各组随机抽取20个样品DNA等量混合,用来构建可育和不育基因池,以此进行对恢复基因的定位。试验使用40对SSR引物扩增基因池DNA,获得3个具有多态性的分子标记,分别是Mt2c12、AW166,初步定位Rf基因在类群Composite5上。将类群Composite5上所有引物进行合成,进一步进行引物筛选,最终获得4个具有多态性的标记BI68、Mt2c12、BG267和AW776153遗传距离分别为19.0cM,20.9 cM,44.6 cM,72.1cM。