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第一部分:应用氪离子激光建立大鼠脉络膜新生血管模型目的1.探讨应用氪离子激光建立棕色挪威大鼠（Brown Norway,BN）脉络膜新生血管（Choroidal neovascularization,CNV）模型的有效性和安全性。2.观察氪离子激光光凝后CNV形成及变化规律,并确定CNV形成和高峰时间,为进一步研究CNV的发生机制及探索新的基因治疗方法提供理论依据。方法选取6～8周雄性BN大鼠25只（50只眼）,从中随机选取一只大鼠（2只眼）作为空白对照组,其余24只大鼠（48只眼）作为实验组,再根据光凝后不同观察时间,将实验组随机分为6个亚组,每个亚组4只大鼠（8只眼）。空白对照组不做任何处理,只用于与实验组激光光凝后视网膜荧光血管造影（Fundus fluoresceinangiography,FFA）、病理及透射电镜变化作对照。手术方法为用846复合麻醉剂0.5ml/Kg腹腔注射充分麻醉动物,激光光凝前5min用复方托品酰胺眼液滴眼一次,充分散大双眼瞳孔。固定动物,在-53.00D角膜接触镜辅助下,围绕视盘并在距视盘2PD位置等距离行氪离子激光光凝,共计8个光凝斑,激光波长为647.1nm,功率为350mW,光凝斑直径和时间分别为50μm及0.05s。光凝后立刻行眼底照相。于光凝后3、7、14、21、28及56天分别各随机抽取4只实验组大鼠,行FFA、组织病理及透射电镜检查。结果1.通过眼底照相及FFA检查证实,光凝后第7天光凝斑部位开始出现圆盘状荧光素渗漏（190/16×20,59%）,14天光凝斑荧光素渗漏增加（172/16×16,67%）,21天光凝斑荧光素渗漏达高峰（162/16×12,84%）（P＜0.01）;21天后光凝斑荧光素渗漏稳定,28天光凝斑渗漏为（106/16×8,83%）,56天光凝斑渗漏为（52/16×4,81%）（P＞0.05）。2.病理组织学检查:光凝后3天,光镜下显示光凝区视网膜色素上皮（Retinalpigment epithelial,RPE）层和Bruch膜破裂,脉络膜毛细血管层受到破坏;电镜下显示脉络膜血管管腔内有内皮细胞和红细胞。在靠近视网膜一侧血管,见有内皮细胞胞突和内皮细胞围成的不完全管腔样结构。光凝后7天,光镜下显示光凝区视网膜全层水肿、隆起;电镜下显示脉络膜近视网膜处有新生毛细血管,管腔内附着内皮细胞胞突,红细胞游离于管腔中。光凝后14天,光镜下显示视网膜水肿消退,新生血管增多;电镜下显示色素上皮细胞内靠近基部有明显的空腔,色素颗粒减少;高倍视野下,色素上皮细胞胞质内的细胞器结构不清,色素颗粒减少,基部的绒毛呈溶解性改变,顶部的板层小体呈溶解性改变并形成大量的空腔。光凝后21天,光镜下显示CNV呈现显著的纤维血管增殖（Fibrovascular proliferation,FVP）,其中可见大量新生血管,管腔内可见红细胞;电镜下显示脉络膜黑色素细胞间有毛细血管呈凝聚性改变,内皮细胞凝聚,血管腔内多个红细胞形似腊肠。高倍下,基膜和血管壁之间的结构不清,见有大量胶原纤维和弹力纤维。21天后,光镜显示CNV保持稳定FVP状态。光凝后56天,光镜下显示光凝斑中央外层视网膜向内层凹陷,CNV中存在大量的纤维细胞和新生血管。3.CNV中央最大厚度:光凝后7天至21天CNV中央最大厚度显著增加（P＜0.01）,21天后无明显改变（P＞0.05）。4.并发症:少数激光光凝斑处可见视网膜下少量出血（8/384）,余未见玻璃体出血,视网膜脱离,脉络膜脱离及视网膜表面膜形成等并发症。结论1.应用氪离子激光成功建立BN大鼠脉络膜新生血管模型。2.氪离子激光光凝后第7天CNV开始形成,14天增加,21天达到高峰,21天后趋于稳定。3.本试验所建立BN大鼠脉络膜新生血管模型成模时间短,持续时间长,成模率高,为进一步研究CNV发生机制及探索Ad-PEDF治疗提供稳定可靠的动物模型。第二部分:重组腺病毒Ad-PEDF构建及其真核表达的实验研究目的建立携带色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor,PEDF）基因的重组腺病毒,为进一步基因治疗脉络膜新生血管（choroidal neovasculrization,CNV）奠定基础。方法1.从棕色挪威大鼠（Brown Norway,BN）视网膜组织中提取总RNA。巢式RT-PCR扩增PEDF基因cDNA,将PEDF克隆入T载体,行DNA序列分析。提取PEDF质粒和腺病毒穿梭质粒pDC316,以EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭载体pDC316/PEDF,提取重组质粒后以SacⅠ酶进行酶切鉴定并进行DNA序列分析。脂质体法将pDC316/PEDF质粒与腺病毒基因组骨架质粒共转染293细胞,利用Cre/loxp位点同源重组方法构建重组腺病毒Ad-PEDF,行PCR鉴定后,大量扩增并以氯化铯（Cesium chloride,Cscl）梯度法纯化,检测重组腺病毒滴度。2.检测PEDF在真核细胞中的表达。以Ad-PEDF感染体外培养的HepG2细胞,1h后更换为等量无血清培养液,培养48h后收集上清,同时以未感染Ad-PEDF的HepG2细胞培养上清作为对照行Western blot检测PEDF的表达。结果1.基因测序结果表明,所克隆的PEDF基因包含了大鼠PEDF基因阅读框内的全部序列,与NCBI Sequence Viewer中公布的大鼠PEDF mRNA序列（NM-177927）完全一致。成功构建了重组腺病毒穿梭载体pDC316/PEDF,测序验证了其可靠性,以其与腺病毒基因组骨架质粒共转染293细胞,应用Cre/loxp位点细胞内同源重组方法构建Ad-PEDF,经PCR鉴定证实重组腺病毒构建成功。大量扩增后进行CsCl梯度离心纯化,并行病毒滴度测定,滴度达3.08×1010pfu/mL,满足了体内和体外试验要求。2.Western blot结果显示感染组细胞上清液有PEDF表达,对照组没有PEDF表达。证明Ad-PEDF能够转染真核细胞使其表达PEDF,并分泌到细胞外。结论成功构建携带PEDF基因的重组腺病毒Ad-PEDF,为基因治疗CNV奠定了基础。第三部分:重组腺病毒Ad-PEDF抑制大鼠脉络膜新生血管的实验研究目的研究重组腺病毒Ad-PEDF对棕色挪威大鼠（Brown Norway,BN）脉络膜新生血管（CNV）的抑制作用;观察CNV减少或消退的变化规律;并比较不同给药方式的治疗效果,从而明确药物疗效及最佳给药途径,为进一步临床实验奠定基础。方法选取6～8周雌性BN大鼠68只（136只眼）,从中随机选取4只大鼠（8只眼）作为空白对照组（N组）,其余64只大鼠（128只眼）作为实验组。根据给药方式不同将实验组随机分为4组:玻璃体腔注射组（A组）、玻璃体腔注射对照组（B组）、球周注射组（C组）、球周注射对照组（D组）,每组16只大鼠（32只眼）,再根据给药后观察时间不同,将每组随机分为4个亚组:3天组、7天组、14天组、28天组,每个亚组4只大鼠（8只眼）。所有大鼠通过氪离子激光光凝建立脉络膜新生血管模型,激光参数为波长647nm,功率350～380mW,光斑直径50μm,曝光时间0.05s。N组:光凝后14天不做任何处理,只用于与两实验组给药后眼底荧光血管造影（FFA）、病理及TUNEL法检测新生血管内皮细胞凋亡作对照。各实验组于光凝后14天先行FFA检查,然后给予不同处理。光凝后14天,A组玻璃体腔注射Ad-PEDF 1μl;B组玻璃体腔注射AdNull 1μl;C组球周注射Ad-PEDF 1μl;D组球周注射AdNull 1μl。各实验组于给药后3天、7天、14天及28天分别各随机抽取4只大鼠,FFA检查后处死,摘取眼球行组织病理学及TUNEL检查,观察CNV消退及新生血管内皮细胞凋亡情况。FFA记录光斑渗漏程度,光镜200倍视野下取连续切片的CNV中央最大厚度进行测量,应用SPSS11.5软件进行统计分析。结果1.A组（54.7%）C组（56.3%）给药后比给药前荧光素渗漏减轻（t=2.75;t=3.15,P＜0.01）。2.给药后7天,A组（57.3%）、C组（57.8%）CNV数量减少;B、D组CNV呈显著纤维血管增殖。3.给药后A组（44.51±0.53μm）、C组（44.37±0.48μm）CNV中央最大厚度比N组（46.35±0.93μm）减小（F=7.57,8.85;P＜0.01）,并且随时间延长而减小（F=4.31,5.25;P＜0.05）。给药后3天A组（46.35±0.62μm）CNV中央最大厚度比C组（44.90±0.44μm）大（F=3.55,P＜0.05）;给药后14及28天,A组CNV中央最大厚度比C组减少（F=6.54,P＜0.01;F=4.41,P＜0.05）。4.给药后A、C组CNV内皮细胞出现部分TUNEL阳性细胞。5.玻璃体腔注射除5只眼发生白内障外,无其他并发症。球周注射术后未发现明显并发症。结论1.Ad-PEDF对BN大鼠脉络膜新生血管具有抑制作用。2.BN大鼠脉络膜新生血管于治疗后7天起效,14天抑制作用最强,持续28天。3.玻璃体腔注射方式比球周注射方式起效慢,但玻璃体腔注射方式抑制作用强。4.球周注射方法简单易行,并可重复操作;玻璃体腔注射方法较为复杂,可重复性差,并可引起白内障等并发症。