蜘蛛丝是一种特殊的纤维蛋白,它具有很高的强度、弹性、柔韧性、伸长度和抗张强度,以及轻盈、耐紫外线、生物可降解等优点,是新一代的天然高分子纤维生物材料,其中尤其以蜘蛛拖丝的力学性能最好。本实验室研究人员利用基因工程方法,合成含有细胞粘附位点RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）的重组蜘蛛拖丝蛋白基因,构建了工程菌pNSR-16/BL21（DE3）pLysS。本论文建立了工程菌pNSR-16/BL21（DE3）pLysS的高密度发酵工艺和重组蛛丝蛋白规模化纯化方法,以此为基础原料,制备组织工程用生物材料丝蛋白纤维薄膜和多孔支架,对所制备的材料进行了体外降解、细胞毒性实验。 在工程菌pNSR-16/BL21（DE3）pLysS摇瓶优化培养的基础上,进行10L发酵罐高密度发酵。采用Do-stat补料分批发酵,最终菌体密度OD₆₀₀可在60-90范围,产物表达量约占总蛋白量的11～12%。 通过His·Bind亲和层析小量纯化重组蛛丝蛋白,经等电聚焦电泳测定等电点为6.45,蛋白质印迹分析证明表达蛋白为重组蛛丝目的蛋白。超声破碎细胞,调节pH至9.1,60℃加热8～10mins,15%饱和度硫酸铵沉淀等步骤,可以得到纯度达90%以上的制备性重组蛛丝蛋白。 本研究首次报道了利用重组蛛丝蛋白制备生物支架材料及其部分力学性能的测定。纯化的重组蛛丝蛋白经透析、冷冻干燥后,以98%甲酸为溶剂,制备丝蛋白溶液。将丝蛋白溶液平铺于塑料板上可制备薄膜:加NaCl晶体为致孔剂,通过盐沥滤法可制得多孔支架材料。为改善支架材料的力学性能,将丝纤维蛋白与聚合物共混改性,探讨了变性剂、致孔剂及其比例、干燥方法等对共混支架的结构与性能的影响。 选用弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶,探讨重组蛛丝蛋白支架材料的体外降解行为,证实了重组蛛丝蛋白支架材料具有生物可降解性。 初步进行了重组蛛丝蛋白支架材料体外细胞毒性实验。