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目的克雷伯菌属(Klebsiella)为无芽胞、无鞭毛的革兰阴性杆菌,主要包括肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌等,常寄生于人或动物呼吸道及肠道,是引起人类肺炎的病原菌之一,此外还可导致子宫炎、乳房炎及其他化脓性炎症,甚至败血症。近年来,克雷伯菌属细菌的耐药性逐年增高,甚至出现了泛耐药菌株,给临床感染的控制和治疗带来严峻的挑战。CRISPR-Cas系统是细菌基因组中可抵御外源遗传物质入侵的适应性免疫防御系统。本研究旨在对克雷伯菌属细菌基因组中CRISPR-Cas系统的分布概况及其基因结构等进行系统的分析,并以临床常见的肺炎克雷伯菌为研究对象探讨CRISPR-Cas系统与细菌耐药性之间的关系,为控制细菌间耐药基因的水平传播提供新的思路。方法本研究主要分为两部分。第一部分研究中,部分克雷伯菌的CRISPR阵列信息直接收集于CRISPRdb数据库,其余NCBI下载的细菌的CRISPR基因座的查找通过CRISPRFinder进行;cas基因的查找均通过CRISPR-Cas Finder进行。利用MEGA7.0对所有cas基因及重复序列进行多序列比对和遗传进化分析,并构建系统发育树。重复序列的系统发育分析结果提交到CRISPRmap在线软件中进行分析;重复序列的二级结构及最小自由能(MFE)的预测通过RNAfold进行。间隔序列靶向的外源基因序列的查找通过Blastn进行,靶向的标准定为同源性大于或等于85%。通过DNAStar的EditSeq软件截取前导序列,并利用promoter2.0对截取序列中的启动子进行预测。前导序列的保守性通过Weblogo预测。通过MLST数据库查找肺炎克雷伯菌的MLST分型。检索肺炎克雷伯菌基因组的注释以获得耐药基因信息。利用卡方检验、Fishers’确切概率法等统计学方法研究肺炎克雷伯菌基因组中CRISPR-Cas系统与耐药基因的携带率之间的关系。第二部分对临床分离的肺炎克雷伯菌的CRISPR-Cas系统的分布概况进行了研究,并探讨了其与细菌耐药表型之间的关系;该部分菌株大部分收集于青岛大学附属医院检验科。首先以第一部分生物信息学分析的数据为基础设计引物;通过对肺炎克雷伯菌基因组中cas1基因的分析,利用Primer premier 5软件分别在I-Ea型和I-Eb型cas1基因内部设计了两对引物。进一步通过统计学的方法分析临床分离株CRISPR-Cas系统的存在与细菌耐药表型之间的关系。结果1.441株克雷伯菌属细菌的确定CRISPR阵列的存在比例为37.64%,cas基因簇的存在率为27.21%。肺炎克雷伯菌基因组中含有确定CRISPR阵列的比例为40.53%,cas基因簇为31.95%。克雷伯菌的CRISPR阵列大多数位于染色体上,但有少数位于质粒上。本研究收集的肺炎克雷伯菌临床分离株中cas1基因的携带率为34%。克雷伯菌属的CRISPR-Cas系统大多数属于I-E型,少数为I-F型,肺炎克雷伯菌的CRISPR-Cas系统全部属于I-E型,并且根据其cas基因的系统发育分析结果可分为I-Ea和I-Eb两个亚型。2.441株克雷伯菌基因组中共发现242条确定重复序列,去除相同及反向互补序列后共发现28种,长度为24～48bp,以30bp最多见,平均为29bp。对这28种确定重复序列进行了多序列比对及系统发育分析发现,其大致可分为两类。肺炎克雷伯菌I-Ea亚型中的重复序列较保守,而I-Eb中的重复序列变异较大。441株克雷伯菌的确定CRISPR阵列中共发现4350条间隔序列,经过多序列比对分析去除相同序列后共筛选出1050条不同的间隔序列。将这1050条间隔序列在Genbank中进行Blast检索发现,24.8%的序列与噬菌体同源,26%与质粒同源,41.2%与非克雷伯菌属的细菌基因序列同源,此外,本研究还发现9%的间隔序列靶向其他物种的基因序列。3.通过多序列比对去除了194条假定前导序列中的相同序列,筛选出33种不同的前导序列,系统发育分析结果发现其大致可分为两类,每类又可分为多个亚类,表明克雷伯菌属基因组中位于染色体上的I-E型CRISPR-Cas系统的前导序列之间并不保守。利用Promoter2.0对33种不同的前导序列进行预测,结果未发现启动子结构。I-Ea亚型前导序列75～95bp间AT含量较为丰富,有连续的“AAAA”存在,而I-Eb亚型前导序列中整体的AT含量较低,但在90～95bp间也有“AATAT”存在。4.对肺炎克雷伯菌的MLST分型与CRISPR-Cas系统的分型之间的关系进行分析发现,含有I-Ea亚型CRISPR-Cas系统的细菌的集中分布在ST147、163、253、273、34、383、392、45、485、66、67、941型别,I-Eb亚型CRISPR系统集中分布在ST111、13、14、23、15、1518、1660、1941、234、374、493、505、91型别,两亚型的ST型别分布极少出现交叉现象。5.CRISPR-Cas阳性组中KPC、ANT的携带率低于阴性组;确定CRISPR阵列阳性组的β-内酰胺酶耐药基因TEM和KPC、氨基糖苷类耐药基因APH、ANT的携带率均明显低于阴性组。此外,还发现含有b亚型CRISPR-Cas系统的菌株中TEM、KPC、OXA的携带率均显著低于含a亚型的菌株,而SHV的携带率则高于a亚型组。临床分离株中cas基因阳性组对环丙沙星的耐药率低于阴性组。I-Eb亚型cas基因的菌株组对氨曲南、头孢他啶、头孢曲松、头孢替坦等多个抗生素的耐药率均明显低于含I-Ea亚型cas基因的菌株组,差异均有统计学意义。结论1.肺炎克雷伯菌CRISPR-Cas系统的存在率略低于细菌中的平均水平。2.克雷伯菌属细菌的CRISPR-Cas系统绝大多数为I-E型,并可进一步分为I-Ea和I-Eb两个亚型;少数为I-F型。3.重复序列在同一基因座内高度保守,但在克雷伯菌属不同菌种间,及肺炎克雷伯菌不同菌株间并不具有保守性。4.CRISPR-Cas阴性菌株、I-Ea型和I-Eb型分别分布于不同的ST型,I-Ea和I-Eb CRISPR分型与MLST分型有一定对应关系。5.CRISPR-Cas系统可能仅与部分耐药基因的携带率及耐药表型有关。