背景与目的：尽管急性白血病的治疗效果近年来有了较明显的提高,但仍然有15～30%的病人发生原发性耐药,60～80%的患者完全缓解后因继发性耐药复发而死亡。随着生物学技术快速发展,人们发现真核细胞内蛋白质降解大部分是通过泛素一蛋白酶体通路(Ubiquitin-Protease Pathway, UPP)完成,人白血病细胞含有异常高水平的蛋白酶体活性,且在诱导终末白血病细胞分化时蛋白酶体迅速被下调,表明蛋白酶体的活性与白血病细胞的恶性增殖有着密切相关性,因此蛋白酶体可能成为白血病治疗的新靶点。目前研究证实,蛋白酶体在细胞内蛋白降解、MHC-I类抗原递呈、细胞内部错误折叠蛋白的修复上发挥着重要的功能,多种与细胞周期调控、信号转导、细胞凋亡相关的蛋白的正常代谢,都与其功能的正确执行密切相关。特异性阻断蛋白酶体功能显著改变以上蛋白在细胞内的表达水平,导致细胞内蛋白质代谢发生紊乱,从而诱导细胞发生凋亡,是目前认识的蛋白酶体抑制剂主要的抗肿瘤作用机制。硼替佐米(bortezomib)是第一个被美国FDA批准用于临床的蛋白酶体抑制剂,最开始用于难治、复发性多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)的治疗。后来多项临床试验表明硼替佐米单独或联合其他药物治疗非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病、肺癌、卵巢癌等也具有良好效果。有关硼替佐米治疗耐药急性髓系白血病的研究至今很少,我们前期工作中发现硼替佐米体外能够抑制急性髓系白血病细胞株HL60的增殖并诱导其凋亡,与三氧化二砷(As2O3)联合后作用明显增强,但它们对多药耐药的急性髓系白血病细胞株HL60/ADR的作用如何,及其作用机制尚未清楚,此乃是本研究立题的主要动机。研究方法：选择急性髓系白血病多药耐药细胞株HL60/ADR为研究对象。应用MTT法比较HL60/ADR和HL60细胞对阿霉素的敏感性,以耐药倍数大于30倍定义为耐药。加入非细胞毒浓度的硼替佐米(细胞存活率大于95%)共同培养后,检测HL60/ADR的阿霉素耐药倍数变化。然后用MTT法确定硼替佐米和三氧化二砷的IC50值。将48小时IC50三氧化二砷(15nμM)与不同浓度(10～50nM)硼替佐米联合处理HL60/ADR细胞,以空白处理组为对照,计算细胞的增殖抑制率并与三氧化二砷单药组进行比较,观察三氧化二砷与不同浓度硼替佐米联合的作用。在上述实验的基础上,得出与48h IC50三氧化二砷有协同增殖抑制作用的硼替佐米剂量(10nM),将实验分为10nM和20nM硼替佐米单药处理组、48h IC50三氧化二砷单药处理组、10nM硼替佐米联合48h IC50三氧化二砷处理组,以空白处理组为对照组。应用Hoechst33342染色观察细胞凋亡、AnnexinV-EGFP/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率,同时应用流式细胞仪检测HL60/ADR细胞的阿霉素阳性率、多药耐药相关蛋白1表达率,再用Western blot法检测IκBα、p65、bcl-2、bax、caspase-3、caspase-9、PARP蛋白的表达,荧光定量RT-PCR检测PDCD7、APP基因的表达。HL60/ADR细胞及HL60细胞的24小时阿霉素IC50值的比较,加硼替佐米与否HL60/ADR细胞的24小时阿霉素IC50值的比较采用两样本t检验。不同时间、不同浓度硼替佐米组处理HL60/ADR细胞的增殖抑制率的比较用析因分析,48h IC50三氧化二砷和不同浓度硼替佐米联合处理组细胞增殖抑制率与相同剂量硼替佐米单药组的比较用两样本t检验。不同时间、不同浓度硼替佐米单药组或联合三氧化二砷处理组的细胞凋亡率、多药耐药相关蛋白1表达的比较采用析因分析,同一时间不同实验组之间的比较采用单因素方差分析。硼替佐米、三氧化二砷单药或联合处理HL60/ADR细胞后阿霉素阳性率的比较,各目的蛋白、目的基因表达量的比较均采用单因素方差分析,两两比较在方差齐性时采用LSD法,方差不齐时用Dunnett T3法,P<0.05为差异具有显著性水平。结果：1.HL60/ADR白血病细胞的耐药性确定通过MTT法检测HL60/ADR及HL60白血病细胞对阿霉素的敏感性发现,HL60/ADR细胞的24小时阿霉素IC50值约为16.223μg/ml,HL60细胞的24小时IC50值为0.091μg/ml,计算得出耐药倍数为178.27倍,本实验所用HL60/ADR细胞对阿霉素高度耐药。2.硼替佐米对HL60/ADR白血病细胞耐药倍数的影响与5nmol/L硼替佐米(此浓度条件下24小时细胞存活率≥95%)共同培养24小时后,HL60 /ADR细胞对阿霉素的IC50值降至8.249μg/ml,较不加硼替佐米的IC50值降低了近1倍,差异有显著性(P=0.005)。3.硼替佐米、三氧化二砷单药或联合对HL60/ADR白血病细胞增殖的影响MTT法检测结果显示：硼替佐米对HL60/ADR白血病细胞表现出增殖抑制作用,10～50nM的硼替佐米随处理时间延长和药物剂量增加,细胞增殖抑制率逐渐提高,其中50nM处理48h达最大抑制效果(抑制率69.6%),继续延长作用时间至60h,抑制效果无明显增强(P=0.866)；其48hIC50值约为20nM。三氧化二砷单独应用对HL60/ADR白血病细胞也具有增殖抑制作用,分别用2、4、10、20、30、40μM的三氧化二砷处理HL60/ADR细胞48h,细胞增殖抑制率分别为19.1％、29.7％、36.1％、56.2％、63.5％、69.4％;计算得HL60/ADR白血病细胞的48h三氧化二砷IC50值约为15μM。将15μM三氧化二砷分别与10、20、30、40、50nM的硼替佐米联合,可观察到联合处理后细胞增殖抑制效果均进一步增强,各浓度硼替佐米与三氧化二砷联合组对细胞增殖抑制的效果显著高于硼替佐米单药组(均为P<0.05)。根据药物联合作用公式判断,联合组中只有10nM硼替佐米与15μM三氧化二砷48小时联合呈协同作用关系。4.硼替佐米、三氧化二砷单药或联合对HL60/ADR白血病细胞凋亡的影响Hoechst33342染色形态学观察显示：培养48h后,未加硼替佐米的空白对照组细胞未见明显凋亡发生,核呈弥漫均匀蓝色荧光,而10nM、20nM硼替佐米处理组细胞均出现核固缩、凝集,并有凋亡小体,表现为明亮的颗粒状蓝染,随着浓度增加凋亡小体逐渐增多。硼替佐米与三氧化二砷联合处理组凋亡小体数量均明显多于各单药处理组。AnnexinV-EGFP/PI染色法流式细胞仪检测结果显示：经药物处理后细胞状态以凋亡为主：10nM硼替佐米处理HL60/ADR细胞24小时,其平均早期凋亡率和晚期凋亡率分别为6.07%、9.27%,对照组为2.43%、3.17%；在相同处理时间下,20nM硼替佐米处理组细胞平均早期凋亡率和晚期凋亡率分别为6.05%、13.28%；延长作用时间至48小时,10nM硼替佐米处理组细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别增加至14.5%、27.03%,20nM硼替佐米组细胞早期和晚期凋亡率则明显增高达16.80%、38.04%,均显著高于对照组(分别为3.51%、7.60%,均为P<0.05)。经析因分析,不同时间、不同浓度硼替佐米单药处理组之间的细胞早期和晚期凋亡率均有显著性差异,均为P<0.001。10nM硼替佐米与15μM三氧化二砷联合处理24小时后的细胞早期和晚期凋亡率分别达到17.58%、31.79%,48小时后的细胞早期和晚期凋亡率则分别达到23.38%、51.96%,48小时早期凋亡率和晚期凋亡率均分别显著高于相同剂量的单药组(均为P<0.05)。5.硼替佐米、三氧化二砷单药或联合对HL60/ADR白血病细胞阿霉素摄取的影响流式细胞仪检测细胞阿霉素阳性率显示：HL60/ADR细胞不论在0.5μg/ml还是在1.0μg/ml阿霉素培养体系中,加入10nM和20nM硼替佐米组细胞的阿霉素荧光阳性率均显著高于空白对照组(均为P<0.01)。其中20nM硼替佐米组细胞内的荧光阳性率又高于10nM硼替佐米组(P值分别为0.009、0.002)。15μM三氧化二砷组的荧光阳性率也高于空白对照组(均为P<0.01)。将联合用药组与单药组比较,在0.5μg/ml和1.0μg/ml阿霉素培养体系中,10nM硼替佐米与15μM三氧化二砷联合组细胞内的荧光阳性率较10nM硼替佐米单药组、15μM三氧化二砷单药组均明显增高,均为P<0.05。提示硼替佐米可能促使HL60/ADR白血病细胞摄取阿霉素或使其在细胞内排除延迟,随着硼替佐米浓度的增加这种作用也增加,与三氧化二砷联合处理较单药作用显著提高。6.硼替佐米、三氧化二砷单药或联合对HL60/ADR白血病细胞多药耐药相关蛋白1 (MRP1)的影响流式细胞仪检测细胞显示硼替佐米能降低HL60/ADR细胞的多药耐药相关蛋白1表达率：10 nM、20nM硼替佐米处理24小时后细胞的MRP1表达率从94.82%分别降至92.47%、89.87%,到48小时更降至77.41%、66.09%,除48小时10nM硼替佐米组外其余各组细胞的MRP1表达率均显著低于空白对照组(均为P<0.05)。其中20nM硼替佐米组细胞MRP1表达率又显著低于10nM硼替佐米组,P值均为0.026。经析因分析,不同浓度硼替佐米组间有显著差异(F=20.089,P<0.001),不同处理时间之间有显著差异(F=103.253,P<0.001),硼替佐米对HL60/ADR细胞MRP1表达率的降低呈时间-浓度依赖性。24小时和48小时15μM三氧化二砷组细胞的MRP1表达率分别为91.36%、72.58%,也显著低于空白对照组(均为P<0.01)。将联合用药组与单药组比较,10nM硼替佐米与15μM三氧化二砷联合组细胞的MRP1表达率较10nM硼替佐米单药组、15μM三氧化二砷单药组均明显降低(均为P<0.05)。通过析因分析得出不同药物处理组间MRP1表达率有显著差异(F=52.286, P<0.001),其中除10nM硼替佐米与15μM三氧化二砷组之间无显著差异外,其余组间MRP1表达率均存在显著差异；处理不同时间有显著性差异(F=96.069,P<0.001),处理48小时后MRP1表达率(均值为72.525%)显著低于24小时组(均值为87.970%)。7.硼替佐米、三氧化二砷单药或联合对HL60/ADR白血病细胞IκBα、p65的影响Western blot法检测显示：与空白对照组比较,硼替佐米处理48小时后HL60/ADR细胞IKB-α表达无显著改变(F>0.05), NF-KBp65表达显著减低(P<0.05)。而15μM三氧化二砷处理组IKB-α表达显著降低(P<0.05),和10nM硼替佐米联合处理后细胞IKB-α表达有所升高,但仍较对照组显著低(P<0.05)。p65蛋白在联合处理组的表达较单药组有显著性降低(P<0.05),8.硼替佐米、三氧化二砷单药或联合对HL60/ADR白血病细胞bcl-2/bax、caspase通路的影响与空白对照组比较,硼替佐米处理48小时后HL60/ADR细胞促凋亡蛋白Bax表达显著升高(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减低(P<0.05), caspase通路中的cleaved caspase-3、caspase-9、PARP表达显著性升高(均为P<0.05)并随着剂量增加而增加。结果还显示除bax在联合组与三氧化二砷单药组无显著性差异外,bcl-2、cleaved caspase-3、caspase-9、PARP蛋白在联合处理组的表达均较相同剂量单药组有显著性差异(均为P<0.05)。9.硼替佐米、三氧化二砷单药或联合对HL60/ADR白血病细胞PDCD7、APP基因表达的影响硼替佐米处理48小时HL60/ADR细胞PDCD7、APP基因表达显著减低(均为P<0.05),20nM硼替佐米较10nM硼替佐米表达更低(P值分别为0.001、0.038)。三氧化二砷处理组PDCD7、APP基因表达也明显减低(分别为P<0.001、0.017)。但10nM硼替佐米与15μM三氧化二砷联合用药组这两个基因表达未进一步减低,而较15μM三氧化二砷单药处理组表达显著升高(P值分别为0.008、0.016),与10nM硼替佐米组表达无显著差异,但表达量低于10nM硼替佐米组。结论：1、硼替佐米能使HL60/ADR白血病细胞的耐药倍数降低。2、硼替佐米单药对HL60/ADR白血病细胞具有抑制增殖的作用,其效果呈时间-剂量依赖性。3、硼替佐米能够诱导HL60/ADR白血病细胞凋亡,其作用随着时间的延长和剂量的增加而增强。4、硼替佐米能够提高HL60/ADR白血病细胞内阿霉素的蓄积量,随着剂量增加作用增强。5、硼替佐米与三氧化二砷联合作用于HL60/ADR白血病细胞的上述效果均比两者单药处理时的作用效果显著增加。6、硼替佐米能够降低HL60/ADR白血病细胞的多药耐药相关蛋白1的表达,其作用呈时间-剂量依赖性,与三氧化二砷联合作用更明显,这与其增加HL60/ADR细胞内阿霉素浓度、逆转细胞耐药密切相关。7、硼替佐米能够稳定I-KB、抑制NF-KB活化,及抑制抗凋亡蛋白、增加促凋亡蛋白表达、激活caspase通路,并能下调与细胞增殖、凋亡相关的PDCD7、APP基因表达,这些均可能参与其逆转HL60/ADR白血病细胞耐药的作用机制。