目的:肺癌是我国发病率极高的恶性肿瘤,其中,非小细胞肺癌（Non Small Cell Lung Cancer,NSCLC）约占全部肺癌病例的85%。尽管分子免疫及靶向药物等干预手段的广泛使用,以铂类药物为基础的联合化疗仍为治疗NSCLC的首选方案,但其多发耐药性严重影响临床治疗。耐药细胞常存在凋亡抵抗,探索诱导NSCLC顺铂耐药细胞触发非凋亡依赖性的细胞死亡可为其治疗提供新策略。四君子汤具有抗肺癌及耐药的作用,深入研究其作用机制,探索如何增加NSCLC对铂类药物敏感性的研究具有极为重要的社会意义和应用价值。肿瘤细胞的特征之一即代谢重编程,本研究首先通过谷氨酰胺剥夺诱导肿瘤细胞产生适应性应答,分析和对比NSCLC顺铂敏感与顺铂耐药细胞代谢表型的差异,明确NSCLC顺铂耐药细胞的代谢特征。其次,结合网络药理学和实验研究,从肿瘤细胞的谷氨酰胺代谢重编程和四君子汤诱导铁死亡角度阐明四君子汤增敏NSCLC顺铂耐药的机制,以期为四君子汤在NSCLC顺铂耐药中的临床应用提供实验室依据。材料与方法:论文一:（1）光镜法/CCK-8法比较谷氨酰胺剥夺处理48h对A549和A549/DDP细胞形态学和细胞存活率的影响。（2）透射电镜法比较谷氨酰胺剥夺对两种细胞自噬水平和细胞凋亡水平的影响;Annexin V-FITC/PI染色并使用Z-VAD-fmk比较谷氨酰胺剥夺诱导两种细胞凋亡率的差异;自噬抑制剂Bafilomycin A1比较谷氨酰胺剥夺诱导两种细胞自噬水平的差异。（3）RNA-Seq及western blot法比较两种细胞有氧糖酵解及线粒体呼吸m RNA/蛋白水平差异;Seahorse比较两种细胞对不同营养底物的代谢依赖性,同时分析谷氨酰胺剥夺条件下两种细胞的基础/最大OCR及ATP水平差异;Western blot法比较谷氨酰胺剥夺条件下两种细胞线粒体呼吸链复合物蛋白表达的差异,在A549/DDP细胞中Si-SDHB观察其能否进一步抑制细胞存活。（4）Western blot检测谷氨酰胺剥夺条件下两种细胞铁代谢相关蛋白表达差异;C11-BODIPY581/591、ROS和GSH比较谷氨酰胺剥夺条件下两种细胞氧化应激的差异;铁螯合剂去铁胺（deferoxamine,DFO）联合谷氨酰胺剥夺观察其对两种细胞形态学和细胞存活率的影响。（5）Western blot/比色法检测DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞铁代谢相关蛋白表达和总铁离子水平的影响;Seahorse检测DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞的基础/最大OCR和ATP水平的影响;Western blot法检测DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞线粒体呼吸链复合体蛋白表达的影响;C11-BODIPY581/591比较DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞脂质过氧化水平的影响;CCK-8法观察NAC能否挽救DFO联合谷氨酰胺剥夺诱导的细胞存活率下降。（6）JC-1法检测DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的影响;Annexin V-FITC/PI流式细胞术观察DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞凋亡的影响;CCK-8法观察Z-VAD-fmk能否挽救DFO联合谷氨酰胺剥夺诱导的A549/DDP细胞凋亡;western blot法检测DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞凋亡相关蛋白表达的影响;使用Bafilomycin A1观察DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞自噬水平的影响;western blot法检测DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞MAPK信号通路蛋白表达的影响。（7）使用BALB/c-nu小鼠皮下注射A549/DDP细胞,观察DFO在体内对肿瘤细胞生长的抑制作用。论文二:（1）CCK-8法检测不同浓度四君子汤含药血清对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞存活率的影响;Calcein/PI双染观察不同浓度四君子汤含药血清对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞死亡的影响。（2）比色法检测四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞ATP水平及乳酸含量的影响;western blot法检测四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞有氧糖酵解和线粒体呼吸链相关蛋白表达的影响;Mitotracker观察四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞线粒体形态的影响。（3）JC-1法检测四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞MMP的影响;DCFH-DA/Mitotracker/Hochst33342比较四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞线粒体ROS水平的影响;CCK-8法检测NAC能否挽救四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞存活率的抑制作用。（4）Western blot法检测四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞铁代谢蛋白表达的影响;比色法及二价亚铁离子荧光探针Ferro Orange检测四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞匀浆/培养液中总铁离子及细胞内二价亚铁离子含量的影响;C11-BODIPY581/591比较四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞脂质过氧化水平的影响;此外,比色法检测四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞GSH水平的影响。（5）首先,透射电镜法观察Ferrostatin-1能否挽救四君子汤含药血清联合顺铂诱导的谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞铁死亡;其次,DCFH-DA/Mitotracker/Hochst33342比较Ferrostatin-1能否挽救四君子汤含药血清联合顺铂诱导的谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞线粒体ROS积聚;此外,C11-BODIPY581/591比较Ferrostatin-1能否挽救四君子汤含药血清联合顺铂诱导的谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞脂质过氧化;最后,CCK-8法比较Z-VAD-fmk和Ferrostatin-1能否挽救四君子汤含药血清联合顺铂诱导的谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞死亡。（6）Western blot法检测四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺条件下A549/DDP细胞Keap1/Nrf2通路蛋白表达的影响;免疫荧光法检测四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞Nrf2蛋白核定位的影响;Western blot和CCK-8法观察Si-Keap1在四君子汤含药血清联合顺铂诱导谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞死亡中的作用;使用western blot法检测四君子汤含药血清联合顺铂对谷氨酰胺剥夺条件下A549/DDP细胞p62和LC3B蛋白表达的影响;最后,使用CCK8法观察3-MA对四君子汤含药血清联合顺铂诱导的谷氨酰胺剥夺条件下A549/DDP细胞死亡的影响。论文三:（1）使用C57BL/nu小鼠四君子汤联合顺铂对裸鼠肿瘤细胞生长的影响;HE及免疫组化Ki67染色观察四君子汤联合顺铂对裸鼠肿瘤细胞生长的抑制作用。（2）Western blot法检测四君子汤联合顺铂对裸鼠肿瘤细胞谷氨酰胺代谢、有氧糖酵解和线粒体呼吸相关蛋白表达的影响;比色法检测了四君子汤联合顺铂对肿瘤组织ATP、H2O2水平的影响。（3）比色法检测四君子汤联合顺铂对肿瘤组织总铁离子水平的影响;western blot法检测四君子汤联合顺铂对肿瘤组织铁代谢相关蛋白表达水平的影响;透射电镜法观察四君子汤联合顺铂对肿瘤组织特征性形态学的影响;TUNEL染色/western blot法观察四君子汤联合顺铂对肿瘤组织细胞凋亡水平的影响;最后,使用比色法检测四君子汤联合顺铂对肿瘤组织GSH和MDA的影响。（4）Western blot法检测四君子汤联合顺铂对肿瘤组织自噬及Keap1/Nrf2通路相关蛋白表达水平的影响;使用免疫荧光法观察四君子汤联合顺铂对肿瘤组织x CT,Keap1,Nrf2蛋白表达及核定位的影响。结果:论文一:1.NSCLC顺铂耐药细胞不仅获得顺铂耐药表型特征,同时也获得谷氨酰胺剥夺的适应性在施加谷氨酰胺剥夺的代谢压力下,A549细胞表现出碎裂、不规则的细胞形态,而A549/DDP细胞显示出长梭形的形态学变化。此外,与A549细胞比较,A549/DDP细胞在谷氨酰胺剥夺的代谢压力下细胞存活率更高。2.NSCLC顺铂耐药细胞在谷氨酰胺剥夺的代谢压力下上调保护性自噬及凋亡抵抗水平首先,与A549细胞比较,透射电镜观察发现谷氨酰胺剥夺诱导A549/DDP细胞形成显著自噬小体而凋亡小体较少。其次,谷氨酰胺剥夺显著上调A549细胞的细胞凋亡率,而并未影响A549/DDP细胞的细胞凋亡率;此外,凋亡抑制剂Z-VAD-fmk仅挽救谷氨酰胺剥夺诱导的A549细胞死亡,但不能挽救A549/DDP细胞死亡。不仅如此,谷氨酰胺剥夺抑制A549细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达的同时促进促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的激活,而A549/DDP细胞表现出Bax和Caspase-3蛋白明显减少并伴随着Bcl-2轻微下降的变化。最后,使用自噬抑制剂Bafilomycin A1观察发现A549/DDP细胞LC3B-II和p62蛋白表达均显著高于A549细胞。3.NSCLC顺铂耐药细胞在谷氨酰胺剥夺的代谢压力下转向更依赖于葡萄糖驱动的线粒体次呼吸链首先,与A549细胞相比,A549/DDP细胞HK2,PKM2及SDHB的m RNA和蛋白表达均上调。其次,在含有谷氨酰胺的培养液中,Seahorse检测两种细胞的基础呼吸和最大呼吸未见差异,但A549/DDP细胞在谷氨酰胺剥夺后显示出更高水平的基础呼吸、最大呼吸和ATP水平。最后,A549/DDP细胞在谷氨酰胺剥夺的代谢压力下具有更高的SDHB蛋白表达,且谷氨酰胺剥夺增强Si-SDHB对于细胞存活率的抑制作用。此外,Kaplan-Meier分析718例肺腺癌患者,结果发现SDHB高表达与较短的总生存率相关。4.谷氨酰胺剥夺上调NSCLC顺铂耐药细胞的铁存储能力,但赋予其对铁螯合剂如DFO敏感的表型特征首先,谷氨酰胺剥夺下调A549细胞FTH蛋白表达而上调A549/DDP细胞FTH并下调DMT1蛋白表达。其次,与A549细胞相比,谷氨酰胺剥夺条件下A549/DDP细胞脂质过氧化C11-BODIPY581/591和ROS水平更低而GSH水平更高。最后,与A549细胞相比,铁螯合剂DFO联合谷氨酰胺剥夺显著破坏A549/DDP细胞形态并抑制细胞存活。5.DFO破坏铁稳态,可能通过诱导缺铁性应答和氧化应激促进谷氨酰胺剥夺NSCLC顺铂耐药细胞死亡首先,DFO联合谷氨酰胺剥夺显著上调A549/DDP细胞Tfr-1和DMT1蛋白表达的同时下调FTH蛋白表达,但未影响Fpn蛋白表达;同时,DFO联合谷氨酰胺剥夺显著下调A549/DDP细胞内总铁离子浓度。其次,Seahorse发现DFO联合谷氨酰胺剥夺显著下调A549/DDP细胞基础呼吸、最大呼吸和ATP水平。同时,DFO联合谷氨酰胺剥夺显著下调A549/DDP细胞C-I/II/III蛋白表达。最后,DFO联合谷氨酰胺剥夺显著诱导A549/DDP细胞脂质过氧化;不仅如此,NAC可挽救DFO联合谷氨酰胺剥夺对A549/DDP细胞的生长抑制作用。6.DFO通过ROS依赖JNK信号通路促进谷氨酰胺剥夺NSCLC顺铂耐药细胞凋亡及自噬性细胞死亡首先,DFO联合谷氨酰胺剥夺显著下调A549/DDP细胞MMP并上调A549/DDP细胞的细胞凋亡率;此外,凋亡抑制剂Z-VAD-fmk可完全挽救DFO联合谷氨酰胺剥夺诱导的A549/DDP细胞凋亡;不仅如此,DFO联合谷氨酰胺剥夺显著诱导A549/DDP细胞促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase-3激活,同时抑制A549/DDP细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达。其次,使用自噬抑制剂Bafilomycin A1观察发现DFO联合谷氨酰胺剥夺显著诱导A549/DDP细胞自噬。最后,DFO联合谷氨酰胺剥夺上调A549/DDP细胞JNK蛋白的磷酸化水平,而非p-p38和p-ERK,并且,使用JNK1特异性抑制剂JNK-IN-8可完全挽救DFO联合谷氨酰胺剥夺诱导的A549/DDP细胞死亡。7.DFO可抑制NSCLC顺铂耐药荷瘤裸鼠肺腺癌肿瘤的生长与对照组比较,DFO并未影响A549/DDP细胞荷瘤裸鼠体重和瘤重,但显著减缓雄性裸鼠肿瘤细胞的生长。论文二:1.四君子汤含药血清联合顺铂诱导谷氨酰胺剥夺NSCLC顺铂耐药细胞的死亡首先,与顺铂组比较,不同浓度四君子汤含药血清联合顺铂显著抑制谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞的存活,且该效应具有时间和浓度梯度依赖性,即高剂量四君子汤含药血清联合顺铂持续干预A549/DDP细胞48h（联合组）显示出最大的肿瘤杀伤效果。其次,使用Calcein/PI双染观察发现,联合组显著促进A549/DDP细胞的死亡。2.四君子汤含药血清联合顺铂诱导谷氨酰胺剥夺NSCLC顺铂耐药细胞的线粒体能量代谢异常首先,与顺铂组比较,联合组ATP水平未见差异而乳酸生成水平下调;其次,联合组有氧糖酵解和线粒体呼吸链相关蛋白Glut1、HK2、PDH、TIGAR、NDUFB8和SDHB蛋白表达上调而LDHA下调;最后,联合组Mitotracker示踪的线粒体形态由线状、均匀分布向聚集形态转变。3.四君子汤含药血清联合顺铂诱导谷氨酰胺剥夺NSCLC顺铂耐药的细胞氧化应激与顺铂组比较,联合组MMP下降同时线粒体ROS水平升高。同时,在使用NAC时,与顺铂组比较,联合组对细胞存活率的抑制作用消除。4.四君子汤含药血清联合顺铂诱导谷氨酰胺剥夺NSCLC顺铂耐药细胞的亚铁离子蓄积和脂质过氧化首先,与顺铂组比较,联合组Tfr-1、DMT1蛋白表达上调而FPN及FTH蛋白表达下调;此外,联合组细胞上清总铁离子水平未见差异而细胞匀浆总铁离子及二价亚铁离子含量上调。其次,与顺铂组比较,联合组脂质过氧化水平升高。最后,与顺铂组比较,联合组GSH水平下调。5.四君子汤含药血清联合顺铂诱导谷氨酰胺剥夺NSCLC顺铂耐药细胞发生铁死亡首先,与顺铂组比较,透射电镜法观察发现联合组线粒体变小,膜密度增厚但细胞核正常;此外,与联合组比较,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可恢复线粒体形态。其次,与联合组比较,Ferrostatin-1可下调线粒体ROS的积聚和脂质过氧化水平。最后,与联合组比较,Ferrostatin-1能够完全挽救四君子汤含药血清联合顺铂诱导的谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞死亡而Z-VAD-fmk无法挽救四君子汤含药血清联合顺铂诱导的谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞死亡;更为重要的是,在Ferrostatin-1存在时,四君子汤含药血清并不能上调顺铂诱导的谷氨酰胺剥夺条件下A549/DDP细胞死亡,而在Z-VAD-fmk存在时,四君子汤含药血清仍能上调顺铂诱导的谷氨酰胺剥夺条件下A549/DDP细胞死亡。6.四君子汤含药血清联合顺铂诱导谷氨酰胺剥夺NSCLC顺铂耐药细胞发生自噬并抑制p62/Keap1/Nrf2信号通路首先,与顺铂组比较,联合组Keap1蛋白表达上调而Nrf2和x CT蛋白表达下调,且免疫荧光法观测到联合组Nrf2核定位的减少。其次,Si-Keap1并使用western blot法验证Si效率发现,与Si-NC组比较,Si-Keap1组Nrf2、x CT及FTH蛋白表达上调,此外,Si-Keap1组无论单独使用顺铂或四君子汤含药血清联合顺铂均显著下调谷氨酰胺剥夺A549/DDP细胞存活率。最后,与顺铂组比较,联合组LC3B-II蛋白表达上调而p62蛋白表达下调,且自噬抑制剂3-MA不能上调谷氨酰胺剥夺条件下A549/DDP细胞死亡。论文三:1.四君子汤联合顺铂显著抑制NSCLC顺铂耐药细胞荷瘤小鼠肿瘤组织的生长使用高剂量四君子汤连续灌胃A549/DDP细胞荷瘤小鼠21日发现,与单独顺铂组比较,联合组小鼠体重未见差异而瘤重下调;此外,HE及免疫组化Ki67染色观察发现,与顺铂组比较,联合组细胞排列松散,Ki67蛋白表达下调。2.四君子汤联合顺铂抑制NSCLC顺铂耐药细胞荷瘤小鼠肿瘤细胞的谷氨酰胺分解并影响其线粒体能量代谢首先,与顺铂组比较,联合组GLS1蛋白表达下降而GS和SLC1A5蛋白表达未见差异。其次,与顺铂组比较,联合组ATP水平未见差异;此外,与顺铂组比较,联合组Glut1,HKII,PDH,TIGAR,PGC-1α,NDUFB8和SDHB蛋白表达上调。最后,与顺铂组比较,联合组H2O2水平显著升高。3.四君子汤联合顺铂诱导NSCLC顺铂耐药细胞荷瘤小鼠肿瘤细胞的脂质过氧化和铁死亡首先,与顺铂组比较,联合组总铁离子水平上调,且Tfr-1、DMT-1及FTH蛋白表达上调,而Fpn蛋白表达下调。其次,与顺铂组比较,透射电镜法观察发现联合组线粒体变小,膜皱缩现象较多但细胞核形态未见异常;此外,与顺铂组比较,TUNEL染色观察发现联合组细胞凋亡率未见差异,且与顺铂组比较,联合组cleaved-PARP,cleaved-Caspase3,Bcl2及Bax蛋白均未见差异。最后,与顺铂组比较,联合组MDA水平上调而GSH水平下调。4.四君子汤联合顺铂诱导NSCLC顺铂耐药细胞荷瘤小鼠肿瘤细胞的自噬并抑制Keap1/Nrf2通路首先,与顺铂组比较,联合组LC3B-II、Keap-1蛋白表达上调,而p62、Nrf2及x CT蛋白表达下调。其次,与顺铂组比较,免疫荧光法观察发现联合组Keap1蛋白表达上调,x CT、Nrf2蛋白表达下调的同时Nrf2蛋白的核定位下调。结论:1.首先,NSCLC顺铂耐药细胞的代谢表现出“混合代谢状态”,即更高的有氧糖酵解水平和更强的线粒体呼吸;其次,NSCLC顺铂耐药细胞在获得顺铂耐药表型的同时增强了对代谢压力如谷氨酰胺剥夺的适应性,同时,其表现出更依赖于葡萄糖驱动的线粒体次呼吸链的代谢特征;最后,NSCLC顺铂耐药细胞代谢的适应性变化赋予其更依赖于铁代谢和对铁螯合剂如DFO敏感的表型特征。2.四君子汤可增强肿瘤细胞葡萄糖驱动的线粒体呼吸,通过抑制p62/Keap1/Nrf2通路并诱导脂质过氧化和自噬依赖性铁死亡增敏NSCLC顺铂耐药。