研究背景：Graves病(Graves Disease, GD)是一种常见的危害人类健康的自身免疫性内分泌疾病。GD患者的特征性表现为甲状腺肿伴明显的毒性症状,肿大的甲状腺产生过量的甲状腺激素,作用于全身组织和器官,引起甲状腺毒症,同时甲状腺内血流速度的加快并有丰富的血管形成。大部分患者甲状腺肿越明显,甲状腺内血管越丰富,病情越难控制,药物治疗疗程越长,探讨甲状腺肿及血管化形成的机制对GD的治疗十分重要。传统观点认为,GD患者的血清中针对甲状腺细胞TSH受体的特异性自身抗体,即TSH受体抗体(TSH receptor antibodies, TRAb),与TSH受体结合后激活腺苷酸环化酶信号系统,导致甲状腺细胞增生和甲状腺激素合成、分泌增加。因此早期研究中,TRAb被认为是GD的主要致病因素,也是引起甲状腺细胞增生从而引起甲状腺肿的主要致病因子。除长期持续的TRAb激活引起的甲状腺细胞的增生外,生长因子表达的增加也被认为是甲状腺肿发生的重要原因,其中以血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的作用较为突出。生长因子以内分泌、旁分泌和自分泌等方式,广泛而精细的地调节甲状腺细胞及其周边细胞的生长、分化和功能,参与甲状腺疾病的发生发展过程。但甲状腺自身抗体如何影响生长因子表达进而在甲状腺肿形成中发挥作用的机制仍不清楚。腺苷是ATP及cAMP的代谢产物,其本身也能够与细胞膜上的腺苷受体结合,通过细胞内的第二信使进一步发挥作用。1992年Ledent等通过将腺苷A2a受体(Adenosine A2a Receptor, A2aR)与甲状腺球蛋白(Thyroglobulin, TG)启动子相连接而建立了甲状腺肿大合并功能亢进的小鼠模型,病理切片显示该小鼠的甲状腺增生明显并有大量的血管形成。因此我们假设,A2aR可能在GD甲状腺肿发生的过程中起到一定作用。此前腺苷A2a受体作为VEGF转录表达的上游调节受体已在其他组织细胞被广泛研究,目前甲状腺上尚未有A2aR与VEGF关系的相关报道。腺苷A2a受体的激活促进血管形成机制的研究大部分集中在肿瘤组织血管新生及缺氧环境诱发血管生成上。缺氧和应激引起腺苷生成增加,A2aR被激活后促进细胞内低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factors-1alpha, HIF-1alpha)进入细胞核,与VEGF启动子上HIF-1alpha结合位点HIF反应原件(HIF-responsive elements, HRE)相结合,直接促进VEGF的转录。近期报道显示,过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1alpha (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Co-activator Protein1alpha, PGC-1alpha)及Ser133磷酸化的cAMP反应原件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, p-CREB)均能够在不依赖于HIF-1alpha的情况下独立促进VEGF的转录。既往研究表明,p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha的表达均与细胞内cAMP的升高有关,而A2aR作为Gs蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors, GPCR),其激活可引起细胞内cAMP的水平明显增高。因此我们认为,A2aR可能通过cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1alpha引起VEGF表达增加。本项目证实腺苷A2a受体存在于甲状腺细胞膜,且有功能活性；A2aR参与Graves病患者自身抗体调节甲状腺细胞VEGF表达,其可能机制是：GD IgG作用于甲状腺细胞,引起cAMP的产生增加,一方面直接通过cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1alpha引起VEGF表达增加；另一方面,cAMP降解使得细胞外腺苷水平升高,从而激活A2aR,进一步引起细胞内cAMP的增多。目的：1、确定A2aR在大鼠甲状腺细胞(Fisher rat thyroid cell line-5, FRTL-5)、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺、小鼠甲状腺及人甲状腺中的mRNA和蛋白表达。2、通过A2aR激动剂或粗提甲亢患者血清IgG (GD IgG)刺激甲状腺细胞,观察VEGF mRNA和蛋白表达的变化,初步探讨GD IgG及A2aR与VEGF表达的关系。3、通过A2aR激动剂或粗提甲亢患者血清IgG刺激甲状腺细胞,检测CREB、p-CREB、PGC-1alpha, HIF-1alpha的蛋白水平,探讨GDIgG及A2aR引起VEGF分泌增加的可能机制。4、通过注射特异性表达人TSH受体的腺病毒建立GD小鼠模型,检测p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha、VEGF的蛋白水平,进一步探讨GDIgG引起VEGF分泌增加的可能机制。5、利用A2aR特异性阻断剂及A2aR特异性小干扰RNA (Small Interfering RNA, siRNA)处理细胞,检测‘VEGF、p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha的表达,探讨A2aR在GDIgG所引起的VEGF表达增加中所起的作用。6、分别使用GD IgG、A2aR特异性激动剂、A2aR特异性阻滞剂处理后获得的甲状腺细胞上清,刺激人脐静脉内皮原代细胞(Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC),检测其增殖情况,探讨GDIgG及A2aR处理后甲状腺细胞对内皮细胞增殖的影响。研究方法：1、细胞培养：1) FRTL-5细胞根据相应参考文献及ATCC细胞培养标准使用Coon’s改良的Ham’s F12培养液中加入6种激素进行培养。2)人甲状腺原代细胞人甲状腺组织剪碎,Ⅰ型胶原酶与胰酶混合液中37℃消化40-60min,过滤后洗涤沉淀并种板,使用含新生牛血清及TSH的DMEM/F12培养基培养。3)人脐静脉内皮细胞以0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA注入脐静脉,细胞分散后洗涤并种板,以含有胎牛血清及成纤维细胞生长因子的M199培养基培养。4)大鼠神经元原代细胞新生大鼠脑组织剪碎,0.25%胰蛋白酶消化后过滤洗涤并种板,以含有胎牛血清、葡萄糖、胰岛素和P-氨基苯酸的DMEM培养液培养。2、动物模型：通过肌肉注射表达人TSH受体的腺病毒建立GD小鼠模型。3、临床病例收集和粗制IgG的提取：收集初发GD患者,取空腹静脉血,采用电化学发光法检测血清TRAb浓度,采用甲状腺B超测量甲状腺体积,并用PEG沉淀法提取血清IgG。4、采用RT-PCR检测A2aR mRNA的表达和VEGF各剪接体mRNA水平变化。5、采用Western Blotting检测A2aR、p-CREB、CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha, VEGF及beta-actin蛋白水平变化。6、采用免疫荧光及免疫组化方法检测A2aR、p-CREB、PGC-1alpha、HIF-1alpha、VEGF在甲状腺组织及细胞中的表达,H&E染色了解组织结构。7、A2aR基因沉默：采用电转法以A2aR特异性siRNA转染FRTL-5细胞以沉默A2aR表达。8、采用酶联免疫分析检测甲状腺细胞内外VEGF蛋白水平。9、采用直接免疫分析方法检测细胞内外cAMP的含量。10、采用MTT及EdU方法检测内皮细胞增殖情况。结果：1、A2aR甲状腺细胞中的表达：在FRTL-5细胞、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺中均扩增出与阳性对照相同的mRNA片段；Western Blotting证实FRTL-5细胞及人甲状腺原代细胞均有与阳性对照相同的蛋白表达；免疫荧光及免疫组化染色证实A2aR蛋白在FRTL-5细胞、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺、小鼠甲状腺、人甲状腺细胞细胞膜上均有表达。A2aR的特异性激动剂可引起FRTL-5细胞内cAMP剂量依赖性的升高(P<0.05)。2、正常培养FRTL-5细胞中可以扩增出4个VEGF亚型：VEGF188, VEGF164, VEGF144和VEGF120,其中,VEGF120和VEGF164是主要成分；人甲状腺原代细胞中则可以扩增出以下4个VEGF亚型：VEGF189, VEGF165, VEGF145和VEGF121,其中,VEGF121和VEGF165是主要成分。与对照组相比,A2aR特异性激动剂CGS21680和粗提GD患者血清IgG均可剂量依赖性增加I FRTL-5细胞和人甲状腺原代细胞VEGF mRNA各剪接体的表达(P<0.05)。FRTL-5细胞内外的VEGF蛋白也随着CGS21680的作用剂量依赖性地增加(P<0.05)。3、磷酸化CREB、PGC-1alpha及HIF-1alpha均是能够与VEGF启动子结合并促进其转录的转录因子。GD IgG及CGS21680均能增加FRTL-5细胞中p-CREB、 PGC-1alpha及HIF-1alpha的表达。与对照组相比,腺苷酸环化酶(Adenylyl cyclase, AC)的特异性激活剂Forskolin可增加FRTL-5细胞中PGC-1alpha、HIF-1alpha及VEGF的表达。而PKA的特异性抑制剂H89可阻断GD IgG及CGS21680对PGC-1alpha和p-CREB表达的促进作用。4、免疫组化证实,在通过注射表达TSH受体腺病毒建立的GD小鼠模型中,甲状腺VEGF、p-CREB、PGC-1alpha表达均较对照组增加,HIF-1alpha变化不明显。5、A2aR特异性阻滞剂可阻断GD IgG对VEGF mRNA及p-CREB和PGC-1alpha表达的促进作用。在FRTL-5细胞中沉默A2aR后,GD IgG对VEGF、p-CREB、 PGC-1alpha和HIF-1alpha表达的促进作用均减弱。6、取处理后的FRTL-5细胞上清培养内皮细胞,GD IgG及CGS21680处理后的细胞上清可促进内皮细胞的增殖；提前加入ZM241385预处理的FRTL-5细胞上清促进内皮细胞增殖的能力较仅有GD IgG处理的细胞上清减弱。结论：1、A2aR在FRTL-5细胞、人甲状腺原代细胞、大鼠甲状腺、小鼠甲状腺及人甲状腺中均有表达,且该受体蛋白表达于细胞膜。激活A2aR增加细胞内cAMP的含量。2、GD IgG刺激甲状腺细胞可经A2aR激活cAMP/p-CREB/PGC-1alpha/HIF-1alpha通路,增加VEGF表达。3、GD IgG通过增加甲状腺细胞的VEGF分泌促进血管内皮细胞的增殖。