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研究背景:缺血性心脏病（Ischemic heart disease,IHD）是世界上关注度极高的心血管疾病之一。目前,心脏再灌注是其主要治疗措施,但在心脏再灌注血流恢复的过程中会加重组织和器官的额外损伤,严重时甚至危及患者生命,通常将这种损伤称为缺血/再灌注损伤（Ischemia/reperfusion injury,I/RI）。在缺血心肌再灌注时,受损的心肌细胞与内皮细胞可释放一系列细胞因子引起局部炎症反应,导致心肌梗死面积增加、心肌纤维化和心功能受损,从而加重缺血性心脏病。越来越多研究证实,Toll样受体4（TLR4）是Ⅰ跨膜蛋白,活化后激活下游核转录因子NF-кB表达,引起大量炎症因子（如IL-6、TNF-α、IL-1β等）的释放,进而加重心肌损伤。诸多研究表明,心肌再灌注期间过表达的自噬会加速心肌细胞的丢失。而炎症与自噬之间的关系众说纷纭,但TLR4/NF-кB信号通路促进炎性因子分泌,进而介导自噬的发生是其主要激活途径。因此,我们需要寻找一种新物质来平衡它们之间的关系显得尤为重要。多项流行病学研究报告指出,富含草药、水果和香料的饮食可以降低心血管疾病的风险。橙皮素（Hesperetin,HES）来源于芸香科柑橘类植物果实,其主要药效成分是生物黄烷酮类,存在多种生物学活性,如改善血脂、抗氧化、抗肿瘤等。近几年研究表明,橙皮素对视网膜、脑及其他器官的缺血/再灌注损伤具有保护效应。但对心脏缺血/再灌注的影响尚不明确。本课题组前期研究已发现,橙皮素能减轻H2O2诱导的心肌H9c2细胞氧化损伤。因此,本研究旨在探讨橙皮素对大鼠心肌缺血/再灌注的影响及机制,为临床治疗缺血性心脏病提供新的思路。本研究分为二部分:在体实验橙皮素对大鼠进行灌胃6周后观察其对心肌缺血/再灌注的效应及其机制是否与炎症、自噬相关;离体实验建立心肌H9c2细胞低氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）模型,使用橙皮素进行预处理,观察其对低氧/复氧诱导心肌H9c2细胞线粒体途径凋亡、炎症及自噬之间的影响。目的:1.观察橙皮素对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响;2.探究橙皮素对心肌缺血/再灌注发挥保护效应的具体机制。方法:1.动物实验分组:选取清洁级健康雄性SD大鼠（4周,90-100 g,50只）,橙皮素进行灌胃6周,随机分5组:假手术组（Sham）,心肌缺血/再灌组（I/R）,橙皮素预处理+心肌I/R组（HES+I/R）,橙皮素预处理+假手术组（HES）,TAK-242+心肌I/R组（TAK-242）。缺血45 min,再灌注3 h。（1）心电图检测橙皮素对大鼠I/R发生心律失常影响;（2）术前术后24 h进行超声心动图检测橙皮素对大鼠I/R心功能影响;（3）采用LDH、CK-MB确定橙皮素对大鼠I/R所致心肌损伤的作用;（4）ELISA法测橙皮素对大鼠I/R心肌组织的MPO活性、血清（IL-6、TNF-α、IL-1β）含量;（5）HE染色观察心肌组织的炎症浸润情况;（6）TUNEL染色和Caspase3活性检测橙皮素对I/R所致心肌细胞凋亡影响;（7）IHC/IF检测CD45、Beclin1、LC3、p62表达;（8）Western blot法检测心肌组织的IL-6、TNF-α、IL-1β、TLR4、p65、Beclin1、LC3、p62蛋白表达;（9）用RT-PCR法检测IL-6、TNF-α、IL-1β、TLR4、p65、Beclin1、LC3的mRNA表达水平。2.细胞实验分组:细胞实验分为常氧对照组（Control）,低氧/复氧组（Hypoxia/reoxygenation,H/R）,橙皮素+低氧/复氧组（HES+H/R）,TAK-242+低氧/复氧组（TAK-242+H/R）,橙皮素组+正常组（HES+Control,HES）。（1）利用CCK-8、LDH法分别测定细胞的存活率与细胞损伤;（2）Hoechst33258染色和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率;（3）利用ELISA试剂盒检测上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β含量;（4）采用Western blot测橙皮素对H/R诱导心肌H9c2细胞TLR4、p65、Beclin1、LC3、p62的蛋白表达;（5）JC-1染色检测线粒体膜电位变化。结果:1.橙皮素通过抑制TLR4/NF-κB信号通路对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护效应及调控炎症、自噬表达1.1橙皮素改善心脏I/R所致心功能降低心电图结果显示,I/R组发生心律失常个数明显增多,HES+I/R组发生心律失常频率少。术前及术后24 h大鼠超声心动图显示,术前各组大鼠心功能无明显变化;术后24 h:与Sham组相比,I/R组LVFS、LVEF明显降低（P<0.01）;与I/R组相比,给予橙皮素处理后明显提高LVFS、LVEF（P<0.05）。1.2橙皮素减少I/R的心肌损伤结果显示与Sham组相比,I/R组CK-MB、LDH明显升高（P<0.05）;橙皮素预处理抑制其升高（P<0.05）。HE染色结果显示:I/R组较Sham组心肌纤维紊乱,心肌细胞变性坏死,伴大量炎性细胞浸润;橙皮素预处理,心肌排列相对整齐,少量炎细胞浸润。1.3橙皮素降低I/R诱导心肌组织MPO活性、血清IL-1β、TNF-α、IL-6的水平结果显示与Sham组相比,I/R组心肌组织MPO活性,血清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量明显升高（P<0.05）;给予橙皮素明显逆转其趋势（P<0.05）。1.4橙皮素减轻I/R所致心肌组织IL-1β、TNF-α、IL-6的蛋白和mRNA表达Western blot和RT-PCR结果得出,与Sham组相比,I/R组提高IL-1β、TNF-α、IL-6的蛋白与mRNA表达水平（P<0.01）;而HES+I/R组显著降低其表达水平（P<0.05）。1.5橙皮素影响大鼠I/R心肌组织CD45分子表达免疫组化结果显示,I/R组阳性染色颗粒明显高于Sham组;给予橙皮素处理,与I/R组相比,阳性染色颗粒明显减少。更进一步证实橙皮素可以减少心肌缺血/再灌注炎性浸润。1.6橙皮素抑制心肌I/R所致TLR4/NF-κB信号通路激活Western blot和RT-PCR技术得出,I/R组相比Sham组TLR4、p65的蛋白与mRNA表达明显上调（P<0.01）;橙皮素预处理后,TLR4、p65蛋白与mRNA表达水平降低（P<0.05）。1.7橙皮素降低I/R所致心肌细胞凋亡与Sham组比,I/R组Caspase3活性和TUNEL阳性细胞数量上升（P<0.01）;给予橙皮素处理后,与I/R组相比,Caspase3活性和TUNEL阳性细胞数量下降（P<0.05）。1.8橙皮素对大鼠I/R所致自噬的作用Western blot和RT-PCR结果显示,与Sham组比,I/R组Beclin1、LC3蛋白和mRNA表达水平增加,p62蛋白表达下降（P<0.01）;HES+I/R组相比I/R组Beclin1、LC3蛋白和mRNA表达水平下降,p62蛋白表达水平升高（P<0.05）。1.9给予TAK-242（TLR4抑制剂）使I/R诱导自噬相关蛋白表达明显下降为了确定橙皮素对心脏保护作用是否通过调节TLR4/NF-κB信号通路实现,尾静脉注射TLR4抑制剂（TAK-242）进一步观察。IF与Western blot结果显示,与Sham组相比,I/R组Beclin1、LC3红色荧光颗粒和蛋白表达水平增多,p62红色荧光颗粒及蛋白表达减少（P<0.05）;与I/R组比,TAK-242处理后Beclin1、LC3红色荧光颗粒及蛋白减少,p62红色荧光颗粒及蛋白表达增加（P<0.05）。2.橙皮素通过抑制TLR4/NF-κB通路调控低氧/复氧诱导心肌H9c2细胞凋亡、炎症、自噬表达2.1心肌H9c2细胞低氧/复氧模型建立和橙皮素最佳浓度确定与常氧对照（Control）组相比,低氧12 h/复氧3 h（H/R）细胞存活率降低到约50%（P<0.05）。给予不同浓度橙皮素（HES）0、6、12、25、50、100μM预处理心肌H9c2细胞4 h,与0μM相比,25μM的HES可使H/R后的细胞存活率显著升高（P<0.05）,LDH释放显著降低（P<0.05）。确定低氧12 h/复氧3 h,橙皮素预处理最佳浓度25μM以便后续实验。2.2橙皮素降低H/R诱导心肌H9c2细胞凋亡Hoechst33258染色和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术显示,与Control组相比,H/R组细胞凋亡数目增加（P<0.05）;而HES+H/R组则较H/R组的心肌细胞凋亡数目降低（P<0.05）。同样I/R组的Caspase3活性较Control组显著升高（P<0.05）;而橙皮素预处理明显逆转Caspase3活性升高（P<0.05）。2.3橙皮素和TAK-242减轻H/R诱导心肌H9c2细胞炎症因子分泌、TLR4、p65的蛋白表达ELISA结果显示,与Control组相比,H/R诱导心肌H9c2细胞上清液的TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显增加（P<0.05）;而HES和TAK-242预处理均可部分逆转这一现象（P<0.05）。Western blot结果显示,与Control组相比,H/R组TLR4、p65蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;HES+H/R组和TAK-242+H/R组均可逆转其趋势（P<0.05）。2.4橙皮素和TAK-242使H/R诱导心肌H9c2细胞自噬相关蛋白的表达水平降低Western blot结果显示,H/R组的Beclin1、LC3蛋白表达较Control组明显上调,p62蛋白表达减少（P<0.05）;给予橙皮素处理后,则可抑制Beclin1、LC3蛋白表达,p62蛋白表达高（P<0.05）。同样给予TAK-242后有相似的结果（P<0.05）。2.5橙皮素和TAK-242改善H/R诱导心肌H9c2细胞线粒体功能紊乱结果显示与Control组比,H/R组线粒体膜电位下降;与H/R组相比,HES+H/R组和TAK-242+H/R组线粒体膜电位均增加（P<0.05）。ATP含量测定结果显示:与Control组相比,H/R组心肌H9c2细胞内ATP含量明显下降（P<0.05）;与H/R组比,HES+H/R组与TAK-242+H/R组均可升高细胞内的ATP含量（P<0.05）。结论:1.橙皮素对心肌缺血/再灌注有保护作用,其机制与减少凋亡、炎症、自噬的程度有关。2.橙皮素是通过抑制TLR4/NF-κB分子信号通路调控心肌缺血/再灌注诱导炎症、自噬、凋亡之间的关系。