论文部分内容阅读
研究背景:最近研究发现,长非编码RNA(lncRNA)通过调控靶基因的表达,进而参与到肿瘤相关信号通路影响肿瘤增殖、侵袭转移等生物学行为,扮演着类似癌基因或抑癌基因的双重角色。LncRNA是一类无编码蛋白能力的新型转录本,但其在肿瘤细胞的增殖、凋亡以及侵袭转移等生物学行为中发挥多种生物学功能。LncRNA PVT1长度为1716 nt,其位于染色体8q24.21区,此区域也包含有骨髓细胞增生(MYC)原癌基因。有研究报道,在人类多种原发性肿瘤中,MYC基因可促进lncRNA PVT1的转录。然而,在非小细胞肺癌(NSCLC)中lncRNA PVT1的生物学功能及潜在的机制尚不明确。研究目的:探讨lncRNA PVT1在NSCLC中的表达及发挥的生物学功能,研究其潜在机制。研究方法:(1)通过GEO数据库中高通量数据分析NSCLC组织中lncRNAs的相对表达量。(2)利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测NSCLC组织及细胞中lncRNA PVT1的相对表达量。(3)MTT、克隆形成实验检测干扰lncRNA PVT1对NSCLC细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测干扰lncRNA PVT1对NSCLC细胞周期及凋亡的影响。(4)构建裸鼠移植瘤模型研究干扰lncRNA PVT1对A549细胞体内成瘤能力的影响。(5)qRT-PCR及western blotting实验检测lncRNA PVT1的下游靶基因。(6)RNA免疫共沉淀(RIP)实验及染色质免疫共沉淀(CHIP)实验研究lncRNA PVT1调控下游靶基因LATS2的分子机制。(7)构建LATS2过表达质粒并通过MTT、克隆形成及流式细胞术研究LATS2的功能。(8)Western blotting实验检测LATS2的下游分子通路。研究结果:(1)分析GEO数据库中NSCLC组织芯片数据发现lncRNA PVT1在组织中高表达。(2)通过qRT-PCR发现lncRNA PVT1在NSCLC组织及细胞系中显著上调,高表达的lncRNA PVT1与肿瘤的TNM分期、大小及淋巴结转移呈正相关,且可提示患者预后较差。(3)MTT、克隆形成实验表明:敲低lncRNA PVT1可抑制NSCLC细胞的增殖;流式细胞术证实:敲低lncRNA PVT1表达可显著阻滞NSCLC细胞周期进程于G1期,并诱导肿瘤细胞凋亡。(4)通过构建裸鼠移植瘤模型证实:干扰lncRNA PVT1表达可显著降低A549细胞的体内肿瘤形成能力。(5)QRT-PCR及western blot实验表明:干扰lncRNA PVT1后,LATS2的m RNA及蛋白表达水平均上调。(6)RIP实验表明:lncRNA PVT1可绑定多梳抑制复合物(PRC2)核心亚基EZH2;CHIP实验表明:lncRNA PVT1募集EZH2到大肿瘤抑制蛋白激酶2(LATS2)的启动子区从而抑制LATS2的转录。(7)外源性过表达LATS2可抑制NSCLC细胞增殖、诱导凋亡、促进周期进程阻滞于G1期。(8)外源性过表达LATS2可通过Mdm2-P53通路抑制NSCLC细胞的增殖并诱导细胞凋亡。研究结论:本项研究首次阐明lncRNA PVT1通过表观调控LATS2的表达从而参与NSCLC发生、发展的过程。PVT1/EZH2/LATS2间相互作用可作为NSCLC诊断及治疗的新靶标。