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[目的]优化外泌体提取分离纯化的方法，并比较各种方法的外泌体提取效率。基于二代测序对AD患者外周血外泌体中miRNAs表达谱进行生物信息学分析，探究AD患者外周血中外泌体中miRNA-150-5p对KC的增殖、凋亡、活化、分化以及炎症的调控及作用机制。
[方法]①收集我院AD患者和健康人的外周血样本，分别采用超高速离心法和exoEasyMaxiKit试剂盒法提取血清中的外泌体，采用电镜与纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)方法比较两种方法下外泌体的分离效率。②应用二代测序技术检测AD患者和健康人(各5例)外周血外泌体中miRNAs及AD患者和健康人(各20例)外周血中mRNA，利用R3.4.1筛选差异表达的miRNA，结合文献选取其中最具有研究价值的miRNA进行分析，利用TargetScanHuman7.1数据库预测该miRNA靶基因，与差异mRNA做交集分析，采用cytoscape3.5.1及其插件ClueGO、CluePedia进行差异基因的GO功能、KEGG信号通路富集。③收集我院AD患者和健康人的外周血样本各30例分离血浆中外泌体。分别将0μg/μl、20μg/μl、40μg/μl、80μg/μl蛋白浓度的健康人外周血外泌体与KC共培养，采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况，采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测各组细胞的凋亡情况，找出最佳实验浓度。根据加入外泌体的外周血来源情况分为三组:AD组、健康人组和对照组，利用荧光定量-PCR(q-PCR)检测各组细胞的活化(K16)、炎症指标(TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2)。④利用q-PCR检测AD患者和健康人外周血外泌体中miRNA-150-5p的水平差异。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价组织中miRNA-150-5p在AD早期诊断中的效能。基于二代测序结果并结合文献分析选取其中与细胞增殖、凋亡、炎症相关的HMGA2基因进行下一步研究。利用免疫组化法与激光共聚焦定性对比AD患者和健康人皮肤组织中HMGA2的阳性表达。根据miRNA-150-5p转染情况将KC分成mimic组、inhibitor组和空转组。采用CCK-8法和流式检测Ki67法测定各组细胞的增殖情况，采用AnnexinⅤ-FITC/PI流式检测各组KC的凋亡水平，利用WesternBlot(WB)检测各组HMGA2的表达水平，利用q-PCR检测各组细胞的活化(K16、SKALP)、分化(K10、IVL、FLG、LOR)、炎症指标(TSLP、IL-1、IL-20、IL-24、IL-25、IL-33、TNF-α、CXCL1、CXCL2)。采用双荧光素酶报告实验检测miRNA-150-5p与HMGA2基因的相互作用关系。⑤根据miRNA-150-5p和HMGA2的转染情况将KC分成空白组(未加任何刺激)、空转组(仅加入lipo)、siHMGA2组(小干扰RNA)、mimic组、inhibitor组和inhibitor+siHMGA2组(加入inhibitor+小干扰RNA)。利用q-PCR检测各组细胞中miRNA-150-5p和HMGA2的水平差异，以验证细胞的转染效率。采用q-PCR和WB分别从mRNA和蛋白水平检测各组Bcl-2、Bax、Caspase3、STAT3、NF-κB、TGF-β、Smad2的表达差异。
[结果]①两种方法均成功提取出外泌体样物质——在透射电镜下观察到均一的微小囊泡，NTA镜下观察到提取物粒径在3nm～200nm之间。与超高速离心法相比，exoEasyMaxiKit试剂盒法提取出的外泌体纯度更高。②在AD患者和健康人外周血外泌体中共筛选出差异表达miRNAs的共19个，其中上调miRNAs14个，下调miRNAs5个。结合文献选取其中最具有研究价值的差异表达的miRNA-150-5p进行下一步分析。数据库预测其靶基因共351个，与外周血中差异表达的mRNA取交集，共有PAX5、MUC21、SOGA3、HMGA2四个基因。通过GO注释共得到1339个生物学过程注释信息、204个细胞组分注释、130个分子功能注释信息，基因主要富集在基因表达的转录后调控、核运输、翻译调控、细胞-基质连接、mRNA结合等中。KEGG分析显示基因显著富集于STAT3信号通路、NF-κB信号通路、TGF-β/Smad2信号通路、凋亡信号通路等82个通路中。③加入40μg/μl蛋白浓度外泌体的KC增殖率较其他组别显著降低，而凋亡率明显升高(P＜0.001，P＜0.001)。较于对照组和健康人组，AD组中K16、TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2的表达水平均呈不同程度上调趋势(P＜0.05)。④与健康人对比，AD患者外周血外泌体中miRNA-150-5p的表达水平显著降低(P=0.0018)。ROC曲线示miRNA-150-5p诊断AD的曲线下面积为0.723(95％CI0.584～0.863)。免疫组化法与激光共聚焦结果均表明AD患者皮肤组织中HMGA2阳性表达比健康人呈升高趋势。较于inhibitor组和空转组，mimic组中HMGA2含量显著降低(P＜0.001);KC细胞增殖率降低而凋亡率升高(P＜0.001，P＜0.001);K16、SKALP、K10、IVL、TSLP、IL-1、IL-20、IL-24、IL-25、IL-33、TNF-α、CXCL2表达下调(P＜0.05)，而LOR、FLG表达上调(P＜0.05)。双萤光素酶检验结果显示HMGA2为miRNA-150-5p的下游靶基因(P＜0.001)。⑤较于空白组和空转组，mimic组中miRNA-150-5p的表达水平明显升高(P＜0.05)，inhibitor组和inhibitor+siHMGA2组中miRNA-150-5p的表达水平降低(P＜0.05);mimic组、siHMGA组和inhibitor+siHMGA2组中HMGA2的表达水平不同程度的降低(P＜0.05)，inhibitor组中HMGA2的表达水平呈升高趋势(P＜0.05);mimic组、siHMGA2组和inhibitor+siHMGA2组中Bcl-2的表达水平不同程度的降低(P＜0.05)、Bax和Caspase3的表达水平不同程度升高(P＜0.05)，inhibitor组中Bcl-2的表达水平升高(P＜0.05)、Bax和Caspase3的表达水平降低(P＜0.05);mimic组、siHMGA2组和inhibitor+siHMGA2组中STAT3的表达水平降低(P＜0.05)，而inhibitor组结果相反。
[结论]采用超高速离心法和试剂盒法均可应用于提取外周血中外泌体，但后者分离效率更高。AD患者外周血外泌体中miRNA-150-5p表达下调，后者可以靶向HMGA2基因通过STAT3和凋亡信号通路来促进KC的增殖、活化及炎症，从而参与AD的发生发展，有可能成为AD诊断和新型生物治疗的靶点。
[方法]①收集我院AD患者和健康人的外周血样本，分别采用超高速离心法和exoEasyMaxiKit试剂盒法提取血清中的外泌体，采用电镜与纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)方法比较两种方法下外泌体的分离效率。②应用二代测序技术检测AD患者和健康人(各5例)外周血外泌体中miRNAs及AD患者和健康人(各20例)外周血中mRNA，利用R3.4.1筛选差异表达的miRNA，结合文献选取其中最具有研究价值的miRNA进行分析，利用TargetScanHuman7.1数据库预测该miRNA靶基因，与差异mRNA做交集分析，采用cytoscape3.5.1及其插件ClueGO、CluePedia进行差异基因的GO功能、KEGG信号通路富集。③收集我院AD患者和健康人的外周血样本各30例分离血浆中外泌体。分别将0μg/μl、20μg/μl、40μg/μl、80μg/μl蛋白浓度的健康人外周血外泌体与KC共培养，采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况，采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测各组细胞的凋亡情况，找出最佳实验浓度。根据加入外泌体的外周血来源情况分为三组:AD组、健康人组和对照组，利用荧光定量-PCR(q-PCR)检测各组细胞的活化(K16)、炎症指标(TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2)。④利用q-PCR检测AD患者和健康人外周血外泌体中miRNA-150-5p的水平差异。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价组织中miRNA-150-5p在AD早期诊断中的效能。基于二代测序结果并结合文献分析选取其中与细胞增殖、凋亡、炎症相关的HMGA2基因进行下一步研究。利用免疫组化法与激光共聚焦定性对比AD患者和健康人皮肤组织中HMGA2的阳性表达。根据miRNA-150-5p转染情况将KC分成mimic组、inhibitor组和空转组。采用CCK-8法和流式检测Ki67法测定各组细胞的增殖情况，采用AnnexinⅤ-FITC/PI流式检测各组KC的凋亡水平，利用WesternBlot(WB)检测各组HMGA2的表达水平，利用q-PCR检测各组细胞的活化(K16、SKALP)、分化(K10、IVL、FLG、LOR)、炎症指标(TSLP、IL-1、IL-20、IL-24、IL-25、IL-33、TNF-α、CXCL1、CXCL2)。采用双荧光素酶报告实验检测miRNA-150-5p与HMGA2基因的相互作用关系。⑤根据miRNA-150-5p和HMGA2的转染情况将KC分成空白组(未加任何刺激)、空转组(仅加入lipo)、siHMGA2组(小干扰RNA)、mimic组、inhibitor组和inhibitor+siHMGA2组(加入inhibitor+小干扰RNA)。利用q-PCR检测各组细胞中miRNA-150-5p和HMGA2的水平差异，以验证细胞的转染效率。采用q-PCR和WB分别从mRNA和蛋白水平检测各组Bcl-2、Bax、Caspase3、STAT3、NF-κB、TGF-β、Smad2的表达差异。
[结果]①两种方法均成功提取出外泌体样物质——在透射电镜下观察到均一的微小囊泡，NTA镜下观察到提取物粒径在3nm～200nm之间。与超高速离心法相比，exoEasyMaxiKit试剂盒法提取出的外泌体纯度更高。②在AD患者和健康人外周血外泌体中共筛选出差异表达miRNAs的共19个，其中上调miRNAs14个，下调miRNAs5个。结合文献选取其中最具有研究价值的差异表达的miRNA-150-5p进行下一步分析。数据库预测其靶基因共351个，与外周血中差异表达的mRNA取交集，共有PAX5、MUC21、SOGA3、HMGA2四个基因。通过GO注释共得到1339个生物学过程注释信息、204个细胞组分注释、130个分子功能注释信息，基因主要富集在基因表达的转录后调控、核运输、翻译调控、细胞-基质连接、mRNA结合等中。KEGG分析显示基因显著富集于STAT3信号通路、NF-κB信号通路、TGF-β/Smad2信号通路、凋亡信号通路等82个通路中。③加入40μg/μl蛋白浓度外泌体的KC增殖率较其他组别显著降低，而凋亡率明显升高(P＜0.001，P＜0.001)。较于对照组和健康人组，AD组中K16、TSLP、IL-25、IL-33、CXCL1、CXCL2的表达水平均呈不同程度上调趋势(P＜0.05)。④与健康人对比，AD患者外周血外泌体中miRNA-150-5p的表达水平显著降低(P=0.0018)。ROC曲线示miRNA-150-5p诊断AD的曲线下面积为0.723(95％CI0.584～0.863)。免疫组化法与激光共聚焦结果均表明AD患者皮肤组织中HMGA2阳性表达比健康人呈升高趋势。较于inhibitor组和空转组，mimic组中HMGA2含量显著降低(P＜0.001);KC细胞增殖率降低而凋亡率升高(P＜0.001，P＜0.001);K16、SKALP、K10、IVL、TSLP、IL-1、IL-20、IL-24、IL-25、IL-33、TNF-α、CXCL2表达下调(P＜0.05)，而LOR、FLG表达上调(P＜0.05)。双萤光素酶检验结果显示HMGA2为miRNA-150-5p的下游靶基因(P＜0.001)。⑤较于空白组和空转组，mimic组中miRNA-150-5p的表达水平明显升高(P＜0.05)，inhibitor组和inhibitor+siHMGA2组中miRNA-150-5p的表达水平降低(P＜0.05);mimic组、siHMGA组和inhibitor+siHMGA2组中HMGA2的表达水平不同程度的降低(P＜0.05)，inhibitor组中HMGA2的表达水平呈升高趋势(P＜0.05);mimic组、siHMGA2组和inhibitor+siHMGA2组中Bcl-2的表达水平不同程度的降低(P＜0.05)、Bax和Caspase3的表达水平不同程度升高(P＜0.05)，inhibitor组中Bcl-2的表达水平升高(P＜0.05)、Bax和Caspase3的表达水平降低(P＜0.05);mimic组、siHMGA2组和inhibitor+siHMGA2组中STAT3的表达水平降低(P＜0.05)，而inhibitor组结果相反。
[结论]采用超高速离心法和试剂盒法均可应用于提取外周血中外泌体，但后者分离效率更高。AD患者外周血外泌体中miRNA-150-5p表达下调，后者可以靶向HMGA2基因通过STAT3和凋亡信号通路来促进KC的增殖、活化及炎症，从而参与AD的发生发展，有可能成为AD诊断和新型生物治疗的靶点。