白血病细胞NB4分化过程中HOXA7的表达及干预研究

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目的:本课题旨在研究人急性早幼粒白血病(NB4)细胞增殖分化过程中同源盒基因(Homeobox genes, HOX)A7的表达情况及全反式维甲酸(All-Trans Retinoic Acid,ATRA)干预细胞后其表达的变化,从而探讨HOXA7与急性白血病发生的关系。方法:1.采用细胞培养技术体外培养NB4细胞株,作为急性早幼粒(M3型)白血病模型。2.细胞增殖-毒性实验(Cell Counting Kit-8,CCK8),确定干预药物的最适浓度及干预时间点。3.实验分组(共四组):(1)对照组(control):不加药物,代之以等量1640培养液。(2)ATRA干预4h组:加入最适干预浓度的ATRA稀释液培养细胞4小时。(3)ATRA干预48h组:加入最适干预浓度的ATRA稀释液培养细胞48小时。(4)ATRA干预96h组:加入最适干预浓度的ATRA稀释液培养细胞96小时。4.以ATRA持续干预各实验组细胞,观察各组细胞的表观生长情况。5.采用瑞氏姬姆萨染色法观察、鉴定各组细胞核,细胞质的变化及其生长分化情况。6.实时荧光定量PCR法,蛋白免疫印迹(Wrestem blot)法,免疫组织化学方法检测各组细胞HOXA7基因及蛋白的表达情况,并分析其表达差异。7.所有数据经统计学软件SPSSl7.O处理,采用方差分析,组间均用LSD法两两比较,P<O.05有统计学意义。结果:1. CCK8细胞增殖-毒性实验得出:ATRA最佳干预浓度为1μmol/l,过低浓度对细胞生长的影响极小,过高浓度毒性大,容易导致细胞死亡。经干预后,细胞增殖受到抑制,且48小时干预作用即很明显,以后随着干预时间的增加,细胞受抑制的作用更加明显。最佳检测时间点分别设为4小时,48小时和96小时。2.鉴定细胞形态:采用瑞氏姬姆萨染色法验证知培养细胞为急性早幼粒白血病细胞。正常组细胞经培养后形态无明显改变;各实验组(培养4,48,96小时组)细胞形态改变,向成熟分化。胞核变得不规则,大小各异,可见分叶、肾形、蚕豆状,核/质比例缩小。且培养48小时,这些变化即很明显。3.在NB4细胞的体外培养过程中,加入适宜浓度的ATRA于培养基持续干预细胞,各实验组细胞增殖受到一定程度的抑制,开始向成熟细胞分化。4.本实验中各实验组的H0XA7基因表达都呈下降趋势,正常对照组就有表达,在干预4小时后表达下降,但不明显,干预48小时后下降明显,而在干预96小时后表达更低,差异有统计学意义。结论: HOXA7基因及蛋白在人急性早幼粒白血病NB4细胞中表达。浓度为1μmol/l的ATRA能下调人急性早幼粒白血病NB4细胞中HOXA7基因、HOXA7蛋白的表达,进而促进NB4细胞向成熟细胞分化。HOXA7基因可能是人急性早幼粒白血病NB4细胞向成熟分化的调控基因之一。据此推测ATRA治疗白血病的机制可能与其调节HOXA7基因及蛋白的表达相关。
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