宿主天然免疫反应在控制病毒感染中发挥了重要作用。巨噬细胞是天然免疫系统的主要免疫细胞。巨噬细胞在艾滋病毒(HIV和SIV)感染的发病机制中的重要性体现在其双重作用：一方面它参与宿主的抗HIV免疫反应；另一方面它是HIV的主要靶细胞和潜藏库。由于HIV可整合于宿主细胞的DNA内,清除靶细胞中的HIV是治愈HIV感染的关键。大量研究表明,HIV能抑制宿主细胞的抗病毒信号途径,造成慢性持续感染。因此,激活被HIV抑制的靶细胞内的抗病毒免疫机制有助于控制和清除病毒。宿主细胞抗病毒天然免疫反应主要依赖于天然免疫受体家族,如可识别HIV的TLR3(Toll-Like Receptor3)和RIG-I (Retinoic Acid-Inducible Gene-I)。TLR3和RIG-I的激活引起的免疫防御反应能抑制病毒感染。本项目重点探讨了TLR3和RIG-I激活巨噬细胞对艾滋病毒的抑制作用和机制。鉴于恒河猴已被广泛用于艾滋病毒感染动物模型,本课题研究了恒河猴巨噬细胞中由TLR3或RIG-I诱导抗SIV和SHIV的天然免疫机制。1.恒河猴巨噬细胞培养方法的研究由于缺乏分离和培养恒河猴巨噬细胞的有效方法。本课题的首要工作是建立一种简单、经济、高效地培养中国恒河猴(Macaca mulatta)外周血单核巨噬细胞(monocyte-derived macrophage, MDM)的方法。将猴外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)用含不同百分比的猴自体血清或胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI1640培养液培养24h后洗弃未贴壁细胞,加入含有猴自体血清或FBS的新鲜培养基继续培养7天后观察细胞形态学。在含2%猴自体血清的RPMI1640培养条件下,大多数(>85%)猴单核细胞能在24h内贴壁,体外分化5-7天后,恒河猴巨噬细胞的纯度大于96%。分化良好的猴单核巨噬细胞贴壁能力强,占据板底大部分区域,胞体形态多样,多数呈长梭形；对LPS刺激敏感,可产生多种巨噬细胞炎性因子。分化良好的猴巨噬细胞对SIV或SHIV均易感,可产生感染性病毒。因此,含2%猴自体血清的RPMI1640培养基适于原代猴单核细胞的贴壁和分化。该方法操作简单,花费少,无需生长因子,且细胞分化效果好。2.SIV感染中国恒河猴的天然免疫反应天然免疫受体TLR3和RIG-I在控制HIV/SIV感染中发挥重要作用。胞内抗病毒因子,APOBEC3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide3G, A3G)、A3F、A3B和A3C,及四种miRNAs (miR-29a、29b、-146a和-9)具有抑制SIV感染和复制的功能。本课题利用SIV感染中国恒河猴模型研究了这些抗病毒因子在感染初期的时序性表达特点。使用SIVmacR71和SIVmac17E-Br毒株通过静脉途径感染4只中国恒河猴,4只猴均出现病毒血症,并在脑脊液(Cerebrospinal Fluid, CSF)中检测到高拷贝的SIV。SIV感染初期,被感染猴的天然免疫被显著激活,并诱导产生多种抗病毒因子。与未感染之前状态相比,SIV感染猴PBMCs的天然免疫受体(TLR3、RIG-I和MDA5),干扰素诱导因子(MxA、OAS-1),胞内抗病毒因子(A3B、A3C、A3F和A3G)及抗SIV miRNAs-CmiR-29a、-29b、-146a和-9)在感染后第7天和第14天均有显著增加,表明天然免疫反应及其诱导因子在早期控制SIV复制中发挥了关键作用。急性病毒血症期,上述四种miRNAs和四种APOBEC3的表达增加与OAS-1的表达呈平行升高趋势。因OAS-1是干扰素途径活化的标志性细胞因子,所以提示在感染早期,上述具抗SIV功能的miRNAs和APOBEC3的表达受干扰素信号途径的调节。本课题的上述研究结果表明,SIV感染的宿主体内TLR3/RIG-I介导的天然免疫反应在感染早期控制病毒复制和扩散中具有重要作用。3.激活TLR3信号途径可抑制SIV在猴巨噬细胞中的复制TLR3能够识别dsRNA并诱导细胞内抗病毒天然免疫反应。本课题的研究发现,poly I:C激活恒河猴巨噬细胞内TLR3信号途径抑制SIV的感染和复制。进一步的机制研究表明,激活TLR3能够诱导I型和III型干扰素及干扰素诱导的抗病毒因子的表达,包括MxA、A3G和tetherin。另外,poly I:C刺激的恒河猴巨噬细胞p趋化因子(CCL3、CCL4和CCL5)表达水平升高。CCL3、CCL4和CCL5是HIV/SIV入胞辅助受体CCR5的配体,可竞争性抑制病毒进入靶细胞。激活的巨噬细胞可产生4种miRNAs (miR-29a、-29b、-146a和-9),是新近证实的胞内SIV抑制因子。本课题的研究发现,TLR3信号途径激活恒河猴巨噬细胞可诱导miR、-29a、-29b和-146a的表达。而敲减IRF3或IRF7的表达能减弱由TLR3激活介导的抗SIV效应,说明IRF3和IRF7是TLR3信号途径的激活诱导产生干扰素的重要调控因子。这些研究结果表明,由TLR3介导的下游信号的激活,并诱导产生的多种抗病毒因子,在病毒入胞和复制的不同阶段抑制SIV在恒河猴巨噬细胞中的复制。4.激活RIG-I信号途径抑制SIV的复制RIG-I信号途径在激活I型干扰素依赖的抗病毒天然免疫反应中发挥重要功能。本课题的结果表明,人工合成的RIG-I配体(5’ppp-dsRNA)激活恒河猴巨噬细胞的RIG-I信号途径能抑制SIV和SHIV的复制。进一步机制研究表明,5’ppp-dsRNA激活的恒河猴巨噬细胞表达高水平的RIG-I,并产生I型和Ⅲ型干扰素,干扰素信号途径的关键调控因子IRF3和IRF7也显著上升。此外,激活RIG-I能够诱导多种胞内SIV限制因子(OAS-1、ISG56、MxA、tetherin、SAMHD1、A3G、和A3F)的表达,这些限制因子的表达是5’ppp-dsRNA刺激恒河猴巨噬细胞抑制SIV复制的关键因子。综上所述,在建立了适合于体外培养分化猴单核巨噬细胞的方法基础上,本课题重点研究了恒河猴巨噬细胞和SIV感染的相互关系。SIV感染可激活TLR3和RIG-I信号途径,诱导产生多种抗病毒因子,这些因子在控制艾滋病毒复制中发挥了重要作用。本课题的进一步研究证实,激活TLR3和RIG-I信号途径可抑制恒河猴巨噬细胞中SIV复制,其分子机制是激活了Ⅰ型和Ⅲ型干扰素途径,导致产生多种抗艾滋病毒因子,这些因子在病毒入胞和转录水平发挥抑制作用。在艾滋病毒入胞水平,巨噬细胞分泌的β趋化因子(CCL3、CCL4和CCL5)阻止艾滋病毒进入靶细胞；在胞内水平,TLR3/RIG-I激活的巨噬细胞可产生多种艾滋病毒复制的限制因子,如A3G、tetherin、ISGs以及miRNAs,这些限制因子在艾滋病毒复制的不同时段抑制病毒,使病毒很难产生拮抗性突变。因此,激活TLR3/RIG-I信号途径有助于有效地控制艾滋病毒感染和复制。本课题的结果为研发以激活靶细胞内抗病毒天然免疫为基础的艾滋病毒新疗法提供了科学依据。