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单端孢菌素是由半知真菌类(Fungi Imperfecti)等产毒真菌,在特定条件下所产生的一种具有四环状12,13-环氧骨架结构的毒性代谢产物。它在自然界中污染十分广泛,对人畜健康危害较大。单端孢菌素对机体各组织器官具有广泛的生物效应,作用机制一般认为是抑制蛋白蛋和DNA的合成。近些年的研究表明,单端孢霉烯族真菌毒素可以诱导肿瘤细胞凋亡在细胞凋亡中,线粒体起着中心调控作用,细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体密切相关。包括caspase激活因子的释放、电子传递链的改变、膜电位的丧失、细胞内氧化还原状态的改变、Bcl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等。本实验首先通过MTT法探索了单端孢菌素对Hep G2细胞活性的影响。通过LDH实验,检测化合物对细胞坏死的作用。DAPI染色观察化合物处理后细胞核形态的变化；DNA ladder实验进一步观察单端孢菌素处理对DNA的损伤作用；然后AV-PI双染流式检测并定量分析了细胞的凋亡率变化。通过形态学,细胞学和分子生物学多重手段验证化合物对细胞的诱导凋亡作用。为进一步探讨了诱导凋亡的机制,我们又利用RT-PCR检测了Bax/Bcl-2和FAS/FASL的表达量变化,并通过Real Time PCR进行确认,以此推断线粒体凋亡通路的激活与否。为了验证ROS的变化,我们采用DCFH-DA荧光探针和ELISA的方法分别检测了胞内和细胞上清中ROS水平；同时我们又考察了化合物对胞内游离的Ca2+浓度的影响以及细胞线粒体膜电位变化。最后,通过Western blotting等手段检测caspase-9和caspase-3的表达及活化情况。结果发现单端孢菌素能有效抑制Hep G2细胞增殖,且成一定的时间剂量依赖关系；且单端孢菌素处理后,细胞上清LDH活性与却对照无明显差异,说明细胞坏死并不明显。DAPI染色荧光拍照发现经单端孢菌素处理24h就可以观察到凋亡形态,核质碎片和皱缩出现；48h后可以看到明显的凋亡小体。DNA-Ladder实验,发现5μg/ml的单端孢菌素处理48h,1.5%凝胶电泳即能观察到明显的180-200bp的凋亡小片段DNA的产生。AV-PI双染细胞,上流式检测发现：10μg/ml的单端孢菌素处理24h凋亡率比对照组升高了37.97%,呈剂量依赖关系；且随时间推移,逐渐从早期凋亡向中晚期凋亡转变。以上实验均证明,单端孢菌素可以诱导Hep G2细胞凋亡。1、5、10μg/ml单端孢菌素处理6h,提取RNA,RT-PCR发现FAS与FASL的表达量均没有明显变化；而Bax相对量分别上升至对照的1.18±0.03；1.22±0.03；1.69±0.05倍, Bcl-2的相对量分别降低为对照的0.85±0.01；0.67±0.06；0.50±0.05倍。胞内ROS水平检测,发现1、5、10μg/ml的单端孢菌素处理Hep G2细胞1 h,即可引起细胞内ROS水平升高；3 h时,ROS水平达到最大,分别为对照的1.38±0.21、1.45±0.13和1.75±0.19倍；之后开始逐渐下降。细胞内游离Ca2+浓度通过荧光探针Fura 2-AM检测发现：1、5、10μg/ml的单端孢菌素处理Hep G2细胞12 h后,升高到对照的1.295±0.02、1.32±0.06和1.43±0.03倍。不同浓度单端孢菌素处理Hep G2细胞6 h,荧光染料Rh123染色,上流式细胞仪检测,发现处理组细胞线粒体膜电位显著降低。Western blotting实验发现单端孢菌素能激活胞浆内活化的caspase-9的高表达；利用caspase-3剪切底物游离发色基团的方法,考察caspase-3的活化程度发现,单端孢菌素1、5、10μg/ml处理24h,胞浆中Caspase-3分别上升至对照的1.46±0.11、1.85±0.24和2.47±0.29倍。由此,可以断定单端孢菌素处理Hep G2细胞后,由于应激反应,短时间内出现ROS水平升高,同时刺激细胞Ca2+内流,使线粒体通透性增加,导致线粒体ΔΨmt下降,释放细胞色素C,激活caspase级联反应,使DNA断裂,产生凋亡小体,导致细胞凋亡出现。