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猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)属于RNA病毒中的单股正链RNA病毒,该病毒与马动脉炎病毒(equine arteritis virus,EAV)、猴出血热病毒(simian hemorrhagic fever virus,SHFV)和小鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV)同属于动脉炎病毒属。PRRS V根据其基因型分为I型(欧洲)和II型(美洲),而国内的流行毒株主要为II型PRRSV。最新研究通过序列分析发现一个普遍存在于动脉炎病毒属的开放性阅读框—ORF5a,利用反向遗传操作系统对ORF5a的重要性进行验证,发现其对EAV起重要作用,并对PRRSV的存活是必需的。但是ORF5a是以何种方式起作用,具体的功能是什么尚不明确,有待进一步的研究。本研究利用反向遗传操作技术,对ORF5a的功能做进一步的探讨,为PRRSV的基础性研究奠定基础。本研究在实验室已有的PRRSV的感染性克隆质粒p Hu N4-F112上进行改造,将ORF5a的起始密码子ATG突变为GTG,构建了ORF5a失活的感染性克隆质粒p Hu N4-F112-Δ5a,体外转染BHK-21细胞后在MARC-145细胞上拯救病毒。结果表明,拯救毒株在MARC-145细胞上传代的第一代可以检测到PRRSV的基因组,但是检测不到病毒蛋白,证明ORF5a的存在是PRRSV存活所必需,并推测ORF5a可能参与病毒蛋白的合成。为了进一步验证ORF5a的功能,将ORF5a插入慢病毒表达载体(p WPXL)中与辅助质粒(p SPAX2、p MD2.G)共转染293T细胞,收获重组病毒,将病毒液上清纯化后感染MARC-145细胞,筛选得到稳定表达ORF5a细胞系,命名为5a M细胞系。将p Hu N4-F112-Δ5a在构建的5a M细胞系上拯救,得到复制缺陷型病毒,说明ORF5a蛋白的稳定表达可以补偿突变株p Hu N4-F112-Δ5a合成病毒粒子蛋白的功能,因而推测ORF5a可能参与病毒的蛋白翻译过程。将拯救出的病毒继续在5a M细胞系上传3代,得到具有感染性的病毒,对其各代基因组进行测序,发现p Hu N4-F112-Δ5a的突变位点发生回复突变—GTG重新变回ATG。另外,当p Hu N4-F112-Δ5a在MARC-145非冻融连续传代,其基因组会持续存在,但ORF5a的突变位点不能回复突变,说明5a M细胞系中ORF5a的补偿可以使突变株p Hu N4-F112-Δ5a的缺陷基因组回复突变形成了具有感染性的病毒粒子。综上所述,ORF5a蛋白失活导致病毒粒子蛋白不能合成,因而对PRRSV的存活是必需的,另外ORF5a的稳定表达使突变株p Hu N4-F112-Δ5a的突变位点GTG回复为ATG。