转基因动物乳腺生物反应器为获得高质量、低成本的药用重组人乳铁蛋白提供可能。但是，人乳铁蛋白在转基因动物乳腺中仍多处于较低水平表达。为此，本研究构建了一对乳腺特异性表达载体，制备了转基因小鼠，通过比较两种不同构件(即是否含有CMV增强子部分)，探讨添加CMV增强子对于提高人乳铁蛋白乳腺特异性表达水平的作用；并且摸索在个体水平筛选转基因高表达个体的方法。 本研究之构建选用牛α s1-酪蛋白的调控序列，包括长2264bp5’端调控区，即含第2外显子起始ATG前部分、第1内含子、第1外显子、5’端上游+818bp序列：共长1440bp的3’端调控区，包括最后外显子(第18外显子)部分、最后内含子(第18内含子)、3’端非翻译区；另外上游拼接了富含ATG的4kb部分，从-2264bp到-6264 bp处。具体序列见GENBANK(登录号X59856)。通过Xhol酶切PG-LF质粒(实验室保存)获得hLF cDNA片段(约2.3kb)，共同构建了由牛α sl-酪蛋白5’端+hLF cDNA+牛αsl-酪蛋白3’端构成人乳铁蛋白cDNA乳腺特异表达载体AF；在AF’构建基础上，从质粒pCEP4载体切下含增强子CMV的DNA片段，由牛α sl-酪蛋白5’端+增强子片段+hLF cDNA+牛α-sl-酪蛋白3’端构建成人乳铁蛋白cDNA乳腺特异表达载体AP。 将AP质粒用Sal1与Not1限制性内切酶消化，回收纯化约11kb的真核表达载体片段。选用C57♂与ICR早进行交配，获得受精卵1491枚，通过原核显微注射法将表达载体片段导入小鼠受精卵雄原核，注射后存活卵数(移植数)630枚，移植受体数37只，受体怀孕数13只，获得出生仔鼠51只，受精卵存活率为42.3％； AF构件的质粒用上述同样方法处理后，制备转基因小鼠，获得受精卵851枚，通过原核显微注射法将表达载体片段导入小鼠受精卵雄原核，注射后存活卵数(移植数)490枚，移植受体数20只，受体怀孕数15只，获得出生仔鼠56只，受精卵存活率为57.6％。通过PCR检测和PCR产物测序，2只AP小鼠整合有外源基因(♀46<＃>、♀42<＃>)，转基因整合率为3.9％。转基因原代小鼠与正常小鼠交配，获得F1代整合小鼠5只，F2代整合小鼠7只，建立人乳铁蛋白转基因小鼠品系。 采用酶联免疫法(ELISA assay)和蛋白印迹(Western Blot)对AP原代转基因小鼠及其后代的乳汁表达水平进行检测。ELISA检测结果表明：在AP转基因原代小鼠和F1、F2代乳汁中人乳铁蛋白表达均呈阳性，其中原代表达量约在3～6g·L<-1> Westem Blot结果表明：转基因小鼠乳清检测有与标准人乳铁蛋白带相一致的条带。此外，转基因小鼠血液、泪液的ELISA检测结果显示，所构建的表达载体具有乳腺特异性。对AF转基因小鼠乳汁收集，送至江苏省原子医学研究所检测，检测结果实验室保存。 通过近交筛选，获得AP转基因纯合子小鼠(♀38<＃>、♂36<＃>)，催乳获得小鼠乳汁，ELISA检测乳汁中人乳铁蛋白有较高表达量。同时利用本实验室已获得的PCL25转基因小鼠(♀2<＃>)，筛选获得纯合子小鼠(♀18<＃>)，两品系远交，筛选获得双重杂合子小鼠。 比较AF与AP，后者在前者的基础上增加了CMV增强子；在转基因小鼠个体表达水平上，后者明显高于前者。此试验结果证实了我们的设想，即牛的α sl-酪蛋白调控序列与CMV增强子复合启动子构建乳腺特异性表达载体，能够大大提高人乳铁蛋白cDNA的表达。本实验还表明，我们所构建的人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体具有很好的乳腺组织表达特异性。同时，转基因小鼠纯合子的筛选，也为我们缩短制备转基因大动物的周期提供理论依据。