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目的:探讨人工培育小鼠MII卵制备胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)的可行性。期望建立适宜的技术模型,用以解决医疗性克隆中人次级卵母细胞(MII卵)来源匮乏的问题。
方法:将新生0.5d的B6D2F1小鼠卵巢同种异体移植至卵巢切除的B6D2F1受体鼠肾被膜下;14d后取出卵巢移植物,分别采用机械法、长时酶解法、短时酶解法、酶解—机械相结合的分离方法分离出窦前卵泡。分离得到的窦前卵泡在不同培养条件下培养12d,观察各组卵泡的存活率、排卵率以及各组卵母细胞的成熟率、受精率:在实验一中,卵丘复合体(cumulus-oocytecomplexes COCs)在人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)培养体系中的不同时间收获,所得COCs行体外受精(IVF)后观察各组COCs的卵母细胞成熟率、受精率和早期胚发育能力。在实验二中,根据培养体系中胎牛血清(fetal calf serum,FCS)浓度分为5%FCS组和1%FCS组,12天后,评价各组卵母细胞的成熟率、受精率和早期胚发育能力。人工培育MII卵所得囊胚转移至成纤维细胞饲养层上继续培养,用常规技术制备胚胎干细胞。
结果:共移植了200枚卵巢至8-10周龄去除卵巢的B6D2F1雌鼠的肾被膜下,移植2周后取到了197个移植卵巢,收获率为98.5%。采用酶解—机械结合法从每个卵巢移植块获得97.13+5.30个卵泡(相当于194卵泡/卵巢),结合法分离卵泡的存活率与单纯酶解法无差别但高于单纯机械法,而该法每块卵巢的卵泡回收量、平均排卵数、卵母细胞成熟率多项指标均高于其它方法,各种分离方法所培育的卵母细胞受精率在各组间并无显著差异。在实验一中,hCG作用26h得到的卵丘复合体比其它组有更高的卵母细胞成熟率;在实验二中,5% FCS组诱导成熟的卵母细胞具有高受精率的趋势。从人工培育MII卵受精得到的囊胚在饲养层上生长良好,可见呈柱状生长的内细胞群(inner cell mass,ICM),将其消化所得细胞在饲养层上扩增,形成典型的ESC克隆。这些ESC克隆在体外传了2代(P1和P2)。
结论:(1)酶解-机械结合法是一个良好的卵泡分离技术;(2) hCG诱导排卵的作用时间为26h;(3)5%血清浓度培养环境对窦前卵泡的生长发育和保持生殖潜能是有利的;(4)本研究所建立的人工系统可从原始卵泡得到MII卵,且该卵经体外受精所得囊胚可用以制备胚胎干细胞。