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猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)是对猪健康造成极大危害的一种单链环形DNA病毒。猪圆环病毒相关疾病(PCV2-associated diseases,PCVADs)给全球养猪业造成了巨大经济损失。核衣壳蛋白(capsid protein,Cap)是PCV2唯一的结构蛋白,60个PCV2 Cap蛋白能够自组装成病毒样颗粒(Virus-like particle,VLPs),该VLPs能刺激机体产生强烈的免疫保护反应。因此,PCV2 VLPs已经做为商业化疫苗的核心抗原,被广泛应用。解析PCV2 Cap蛋白亚基间的相互作用、VLPs组装的分子机理和PCV2体外复制的特性,将为PCV2疫苗开发和理解其分子致病机理奠定理论基础,本研究主要内容如下:1.研究二硫键对PCV2 Cap蛋白亚基间相互作用、VLPs组装及其内化细胞的影响。在大肠杆菌中分别表达两个含组氨酸标签(His-tag)的重组PCV2 Cap蛋白(野生型,hCap-WT蛋白;突变型,hCap-Mt蛋白/C108G),利用镍离子亲合层析法分别纯化这两个Cap蛋白,观察到野生型Cap蛋白亚基间通过保守的半胱氨酸形成二硫键,并进一步形成Cap蛋白二聚体。两个Cap蛋白在氧化或还原环境中进行自组装均能形成VLPs,分子筛验证发现其组装VLPs的效率没有明显的差异,间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)证明组装的VLPs均具有侵染PK-15细胞的能力。因此,二硫键参与Cap蛋白二聚体的形成,但是对PCV2 VLPs组装及其细胞侵染能力没有负面影响。2.建立大肠杆菌蛋白共表达系统,以研究PCV2 Cap蛋白亚基间的相互作用。在大肠杆菌中共表达nhCap-WT蛋白(不含任何标签)和hCap-WT蛋白。重要的是,nhCap-WT蛋白能通过镍离子亲合层析法与hCap-WT蛋白共纯化,揭示PCV2 Cap蛋白亚基间存在其它的分子间相互作用,且上述两个蛋白在氧化或还原环境中进行共组装均能检测到VLPs的形成,IFA结果表明共组装的VLPs均具有侵染PK-15细胞的能力。综上,我们再次证明二硫键不影响PCV2 VLPs的组装,也进一步揭示Cap蛋白亚基间存在着非二硫键的分子间相互作用,并有助于组装形成VLPs。共组装PCV2 Cap蛋白的研究方法有助于解析VLPs的分子组装机理和嵌合型VLPs疫苗的研发。3.探究二硫键对PK-15细胞中PCV2复制的影响。我们将PCV2 Cap中保守的半胱氨酸残基替换为甘氨酸残基(C108G)构建含有该突变位点的感染性PCV2 DNA克隆,成功拯救出PCV2,且病毒DNA拷贝数与野生型相当,表明PCV2 Cap中保守的半胱氨酸残基在PCV2体外生命周期(即感染和复制)中不起关键作用。