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植物进行遗传转化时,选择标记是不可或缺的重要一环。目前,植物转化常用的选择标记主要有两大类——抗生素抗性基因和抗除草剂基因,但现在由它们引起的生物安全性担忧正日趋严重,所以开发一种新型且安全的选择标记越来越被重视。亚磷酸盐脱氢酶（phosphite dehydrogenase,PTDH）是一种依赖于NAD+、将亚磷酸盐（Phi）氧化为正磷酸盐（Pi）的酶。Phi不能被植物直接利用,相反对植物具有毒害作用。基于此特性,目前利用Phi/PTDH组合已建立起一套新型多用途且有广泛应用前景的植物转化显性选择标记/植物磷利用/杂草控制系统。为了打破这套技术系统的国际专利壁垒,其关键点就是鉴定出PTDH的功能替代。由于大肠杆菌碱性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase,BAP）也具有将Phi氧化为Pi的活性且无辅酶依赖性,因此本工作试图通过将它的基因EcBAP（即phoA）转入植物中并以Phi作为选择剂,验证它能否顶替PTDH从而建立起Phi/BAP基础上的类似系统。取得的主要结果如下:（1）EcBAP的基因克隆及其表达载体的构建首先从大肠杆菌DH5α基因组总DNA中扩增出BAP基因（EcBAP）片段,然后分别通过BamH I/Sac I和Nde I/Xho I双酶切克隆到载体pBI121和pET32a（+）中,得到植物表达载体pBI（EcBAP）和原核表达载体pET（EcBAP）并经测序验证。（2）EcBAP转基因烟草的获得及其特性分析（1）以卡那霉素（Kan）为筛选剂进行pBI（EcBAP）的农杆菌侵染烟草转化,在正常MS培养基选择培养8590 d就可获得EcBAP（Kan）转基因烟草,阳性转化率为66.7%。（2）通过比较EcBAP（Kan）转基因烟草和野生型（WT）烟草叶片在含不同Phi浓度的缺Pi或正常MS培养基上的抗性再生,发现EcBAP（Kan）烟草的叶片失绿程度在几乎所有情况下都显著低于WT烟草,但只有在低于3 mM Phi浓度下的正常MS培养基上才有抗性再生绿芽长出。（3）基于（2）中结果,以2.5 mM Phi为筛选剂进行农杆菌介导pBI（EcBAP）的烟草转化,在正常MS培养基上选择培养约68 d就能获得EcBAP（Phi）转基因烟草,阳性转化率为80%。相比较,在缺Pi MS培养基上培养2.5月,任何0.52 mM浓度范围内的Phi作为筛选剂情况下也仅有愈伤分化。另外,RT-PCR结果显示EcBAP（Phi）转基因烟草的根、茎、叶中均有转基因EcBAP的表达。（4）将Phi筛选出的EcBAP转基因烟草与WT烟草在Phi胁迫MS平板上进行种子萌发实验,发现无论是缺Pi还是正常的MS培养基上,WT烟草的幼苗生长显著受Phi抑制且随浓度加剧,而这种现象在EcBAP转基因烟草中相对不明显。而且,在同样Phi胁迫条件下正常MS培养基上的WT和转基因烟草的幼苗生长状况总体上明显好于缺Pi MS培养基。（5）温室条件下将Phi筛选出的EcBAP转基因烟草与WT烟草和杂草（狗牙根和高羊茅）在蛭石/珍珠岩/石子基质中混合播种,结果表明在含120 mg/L Phi的ddH2O浇灌下EcBAP转基因烟草具有明显的生长竞争优势。（3）EcBAP的重组表达、纯化和酶活分析将载体pET（EcBAP）在大肠杆菌BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达。结果显示,重组表达蛋白EcBAP在37℃诱导下的可溶性很低,而在25℃过夜诱导下可溶性有了显著增加。经His标签亲和层析纯化和胶活性染色以及分光光度法酶活测定,证实EcBAP重组蛋白具有氧化Phi为Pi的酶活性,其平均比活为8.463U/mg。总之,上述结果表明,大肠杆菌EcBAP具备将Phi氧化为Pi的能力,能够替代PTDH（作为选择标记）与Phi（作为选择剂）组合一起用于植物的遗传转化,其效率可以媲美甚至优于常用的卡那霉素筛选系统。EcBAP转基因烟草具有Phi抗性并将之转化为可利用的磷素营养,从而较WT烟草和杂草在Phi胁迫下有着明显的生长竞争优势。因此,以Phi/BAP为基础建立的这种新型选择标记/植物磷利用/杂草控制系统可为植物基因工程提供一种新的技术选择。