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目的:整合素(integrins)是一类普遍存在于细胞表面的跨膜糖蛋白。支气管上皮细胞构成气道的上皮屏障,其结构稳定性的维持,依赖于细胞表达的整合素分子与细胞外基质蛋白形成异源粘附,将细胞“锚定”于基膜上。同时,在气道高反应或气道炎症发生过程中,部分整合素亚单位及其配体还参与了炎症细胞的移行和活化,使气道结构和完整性遭到破坏,气道上皮剥脱。本室的前期研究已证实哮喘患者多个粘附分子表达异常,其中integrinβ4在所有哮喘病人检测样本中均表达下调。那么,integrinβ4的表达失平衡在哮喘易感人群中是否具有普遍性;它的异常表达机制是什么;integrinβ4的表达失平衡与哮喘的发生发展过程是否具有密切关系。本课题将围绕这一研究目的,通过哮喘实验动物模型和临床诊断哮喘患者这两方面设计实验来开展研究。方法:一、建立哮喘动物模型,检测integrinβ4表达与哮喘的相关性。1.SPF级SD大鼠12只,按随机数字表法分为哮喘组(n=6),对照组(n=6)。其中哮喘组分别于第1天、第13天经腹腔注射10%OVA和10%氢氧化铝混合液1 ml,14 d后用1%OVA溶液雾化吸入诱喘,每天1次,每次30min,连续7d。对照组用等量生理盐水代替。2.利用小动物呼吸机和Buxco小动物呼吸功能分析系统,测定气道阻力和动态肺顺应性;3.收集肺泡灌洗液中细胞,涂片吉姆萨染色后进行细胞计数及分类。4.无菌条件下取肺组织,进行肺组织切片检查。5.肺组织切片免疫组化观察Integrinβ4在对照组和正常组支气管上皮细胞、基底细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞表达变化。6.Trizol提取肺组织中RNA,Real-time PCR反应观察Integrinβ4在对照组和正常组表达变化。二、临床哮喘患者integrinβ4表达与哮喘的相关性及机制探讨1.Trizol抽提哮喘患者外周血白细胞RNA,随机引物将RNA反转录成cDNA,然后设计特异性的引物和荧光探针(TaqMan探针),进行荧光定量PCR检测integrinβ4表达。2.提取哮喘患者外周血白细胞DNA,应用PCR法扩增哮喘患者外周血白细胞integrinβ4基因5’调控区,进行正反双向测序及序列变异分析。结果:一、Integrinβ4在哮喘动物模型中的表达与哮喘的相关性1、哮喘模型组激发前后气道阻力R_L增加的百分比和动态肺顺应性Cdyn降低的百分比均为对照组的2倍左右。2、哮喘模型组细胞总数及嗜酸性细胞、中性粒细胞比例均高于正常对照组。3、哮喘模型组大鼠存在明显支气管收缩征象及周围炎症细胞浸润,小血管周围、肺泡腔、肺间质大量炎细胞浸润,并可见支气管上皮细胞脱落,肺动静脉周围水肿及呼吸性细支气管阻塞。正常对照组无此变化。以上结果证实哮喘动物模型的成功建立。4、免疫组化显示Integrinβ4在支气管上皮细胞、基底细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞均有较高表达,在哮喘模型大鼠中表达下降。5、Real-time PCR反应测定哮喘模型大鼠Integrinβ4表达下调。二、临床哮喘患者integrinβ4表达与哮喘的相关性及机制探讨1、Real-time PCR检测显示Integrinβ4 mRNA在哮喘患者外周血白细胞中表达下调。2、哮喘患者外周血白细胞Integrinβ4 5’调控区基因序列存在变异。哮喘患者的-nt1029、-nt 1051由G突变为A,-nt1151由T突变为G,-nt 1164由G突变为C,提示哮喘患者5’调控区存在基因突变,该突变可能与Integrinβ4的表达下调有关。结论:Integrinβ4表达下调与哮喘高度相关,并与5’调控区基因序列变异有关。