目的:疟疾是疟原虫经按蚊传播引起的感染性寄生虫疾病,是全球最严重的公共卫生问题之一。传统的消除疟疾措施均存在局限性,部分地区疟疾的发病率和死亡率仍然有所上升。确立新的疟疾防控策略,加快疟疾的消除步伐,是当今世界亟待解决重要的问题,疟疾传播阻断疫苗（transmission-blocking vaccines,TBVs）被认为是行之有效的手段之一。传播阻断疫苗TBVs的基本原理是应用疟原虫有性生殖阶段（包括雌雄配子受精前和雌雄配子受精后两个阶段）的表面抗原免疫个体,诱导机体产生抗体,蚊虫吸食人体血液同时也会吸入人体产生的特异性抗体,之后在蚊体内发生抗原抗体反应,影响疟原虫有性生殖及孢子增殖,进而阻止疟原虫在蚊体内的后续发育,阻断疟原虫的传播。在针对TBVs的研究中,发现了很多抗原在雌雄配子、动合子和合子的表面表达,但仅有少部分蛋白具有明确的传播阻断活性,有效的疟疾疫苗候选抗原不足掣肘了疫苗的研发。因此,筛选疟原虫有性阶段新型的候选抗原,确定其分子结构及免疫学特性,开发高效、安全的TBVs疫苗已成为疟疾防控的关键策略。基于TBVs对消灭疟疾的重要意义,本研究我们采用生物信息学、分子生物学和免疫学等相关实验技术,筛选出了伯氏疟原虫膜表面蛋白Pb33,明确了其表达特点和传播阻断活性。这一研究为Pb33作为疟疾传播阻断疫苗新型候选抗原提供了必需的理论和实验依据。研究方法:1.材料。原核表达载体p ET-32a（+）;大肠埃希菌DE3菌株;伯氏疟原虫ANKA株（P.berghei ANKA）是****大学赠与;BALB/c鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司;斯氏按蚊（Anopheles stephensi）。动物实验均经过******动物伦理委员会批准。2.生物信息学分析。使用疟原虫数据库Plasmo DB（http://www.plasmodb.org/plasmo/）筛选出PBANKA＿081330（P.berghei protein 33）基因序列与其同源及上下游基因,BLAST进行基因比对。在线预测蛋白的信号肽和结构域于SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）。primer-premier 5.0软件设计引物。使用软件绘制质粒图谱。DOG 2.0需要软件绘制蛋白模式图。3.构建Pb33-HA。为了明确目的基因的表达阶段,我们通过同源重组技术加入标签,构建Pb33-HA虫株。4.应用IFA检测Pb33的表达阶段。疟原虫经PBS清洗后经4%多聚甲醛固定,细胞经0.1%Triton X-100透膜,漂洗后用PBS 37°C封闭。加入稀释兔源抗HA tag与鼠源Pbs21 m Ab孵育。加入Alexa Fluor555/抗兔Ig G与FITC标记的抗鼠Ig G孵育。DAPI染色后荧光显微镜观察,Adobe Photoshop分析结果。5.基因敲除型ΔPb33疟原虫株的获取和鉴定。PCR法扩增5′UTR片段后克隆到PL0034载体,构建PL0034-Pb33-5U质粒。再扩增3′UTR片段,并将其克隆到此前成功构建的载体,使用双酶切进行鉴定成功构建出的PL0034-Pb33-5U-3U打靶载体。6.观察ΔPb33疟原虫在小鼠血液阶段的感染能力。5组雌性BALB/c小鼠,其中4组分别腹腔注射1×106ΔPb33 P.berghei型疟原虫,1组注射WT型P.berghei,从感染后的第3天开始,连续采用吉姆萨法染色,镜下观察小鼠外周血的红细胞感染情况。并取血观察组间配子体率及雌雄配子体比率。7.观察ΔPb33疟原虫对有性阶段发育情况的影响。（1）体外有性阶段:a.BALB/c雌性小鼠经腹腔注射ΔPb33或WT P.berghei疟原虫组1×106P.berghei,感染第3天,尾静脉采血检测配子体出丝情况和雌配子活化情况。疟原虫在19至20°C培养24小时。固定和标记培养物,在荧光显微镜下观察动合子形成率。b.在活化或培养前5分钟用不同浓度的saponin处理的WT和ΔPb33配子体样品,裂解红细胞膜,重复体外配子体出丝实验与动合子形成率实验。分辨ΔPb33组配子体不能合成鞭毛并参与形成动合子,亦或胞质内可形成鞭毛但无法穿透包膜导致不能形成动合子。c.既往研究已证实ΔPb48/45可阻断雄性配子体出丝,ΔPb47可阻断雌配子活化。取总配子体数相同的WT,ΔPb48/45,ΔPb47,ΔPb33配子体样本组合,进行受精试验。（2）体内卵囊形成率与蚊虫感染率:小鼠经腹腔注射1×106ΔPb33与WT组P.berghei,3天后喂养至少50只雌性按蚊持续30 min,于雌性按蚊吸血后的第10天,检查蚊胃壁上的卵囊数与蚊感染率8.r Pb33的表达与纯化。IPTG诱导p ET32a-Pb33表达载体,超声破碎菌体后,纯化重组蛋白,SDS-PAGE电泳检测洗脱及透析后的样品。9.r Pb33免疫血清特异性抗体检测。初次免疫后第13天应用ELISA检测r Pb33免疫血清特异性抗体。于初次免疫后第28天和第42天分别进行加强免疫,ELISA法检测抗体。10.对Pb33表达位置进行确定。纯化后的P.berghei裂殖体（Sch）,配子体（Gam）与动合子（Ook）分别与r Pb33免疫血清反应,进行Western Blot检测。11.抗Pb33血清体内传播阻断能力测定。（1）体外有性阶段:1×106P.berghei感染小鼠,第3天尾静脉采血,r Pb33全长蛋白/截短蛋白/对照组免疫血清共同培养,观察雄配子体出丝。另取血液加至动合子培养液,并加入重组全长蛋白/截短蛋白/对照组免疫血清,培养、标记后荧光显微镜观察动合子形成数量。（2）体内卵合子形成率与蚊虫感染率:r Pb33全长蛋白/截短蛋白/对照免疫小鼠,三次免疫后感染小鼠,第3天用小鼠喂养雌性按蚊,在吸血后的第10天,检查蚊胃壁上的卵合子数与蚊感染率。12.统计学分析。结果:1.Pb33是一种高度保守蛋白,在疟原虫有性阶段表达。在Plasmo DB中,我们选择PBANKA＿081330（Pb33）做详细的功能研究。该基因编码331个氨基酸,SMART分析预测显示,Pb33蛋白包含一个信号肽,一个低密度复杂度区和多个跨膜区。BLAST多重序列比对显示,PBANKA＿081330基因在疟原虫种属中高度保守,同时与疟原虫外的生物群体无同源性。2.Pb33基因对疟原虫血液阶段的发育无影响。结果显示,在小鼠感染后第3天,外周血中即可发现疟原虫感染的红细胞,随后ΔPb33与WT组原虫血症均迅速上升,但ΔPb33组红细胞感染率与WT组对比未见明显差异。同样,ΔPb33组与WT组小鼠感染疟原虫后生存曲线无明显差异。此外,在小鼠感染的第3天,ΔPb33与WT组间配子体率和雌雄配子体比率无显著差异。以上结果表明Pb33基因对疟原虫血液阶段的发育无影响。3.ΔPb33疟原虫对有性阶段发育情况的影响。观察ΔPb33疟原虫对有性阶段发育的影响,使用P.bergheiΔPb33或WT疟原虫分别感染后,取尾静脉血进行体外配子体出丝、活化与动合子形成实验。结果显示,与WT组雄性配子体正常出丝比较,ΔPb33组雄配子体完全不能出丝,ΔPb33组雌配子未活化。雌雄配子体体外培养24h后,WT组大部分可发育为成熟的动合子,而ΔPb33组未见动合子的形成。体内卵囊形成率与蚊虫感染率:小鼠经腹腔注射1×106ΔPb33与WT组P.berghei,3天后喂养至少50只雌性按蚊持续30 min,于雌性按蚊吸血后的第10天,检查蚊胃壁上的卵囊数与蚊感染率。发现ΔPb33组感染率和卵囊密度明显降低。WT和ΔPb33配子体样品,裂解红细胞膜,重复体外配子体出丝实验与动合子形成率实验。实验结果显示WT组配子体可出丝,ΔPb33组配子体完全不出丝。WT组可发育成熟的动合子,ΔPb33组未形成动合子。证明ΔPb33组配子体不能合成鞭毛并参与形成动合子,而非胞质内鞭毛无法穿透包膜导致不能形成动合子。取总配子体数相同的WT,ΔPb48/45,ΔPb47,ΔPb33配子体样本组合,进行受精试验,证明ΔPb33可同时影响雄性配子体出丝及雌配子活化。所以,Pb33基因对雄性配子体出丝、雌配子活化、动合子的发育和卵囊的形成均具有至关重要的作用。4.r Pb33的表达与纯化。p ET32a-Pb33表达载体经IPTG诱导,菌体超声破碎后,纯化所得的重组蛋白,收集蛋白洗脱并透析后的样品,采取SDS-PAGE电泳检测,可以观察到明显的目标条带。5.r Pb33免疫血清特异性抗体检测。初次免疫后第13天,ELISA法可见r Pb33蛋白免疫组小鼠的血清抗体水平显著上升。于初次免疫后第28天和第42天分别进行加强免疫,与对照组相比,特异性抗体一直维持在较高水平。6.Pb33表达特点的确定。纯化后的P.berghei裂殖体（Sch）,配子体（Gam）与动合子（Ook）分别与r Pb33免疫血清反应,进行Western Blot检测。在裂殖体、配子体与动合子阶段出现免疫印迹条带,表明抗Pb33免疫血清可与疟原虫抗原反应。取不同阶段的疟原虫与Pb33免疫血清进行IFA试验,显示Pb33主要表达于裂殖体、配子体与动合子且主要表达于细胞表面。7.抗Pb33抗体可阻止部分雄性配子体出丝和动合子的形成。为进一步确定疟原虫有性阶段表达的蛋白Pb33的传播阻断活性,分别采用体外动合子形成和直接蚊喂养实验。抗Pb33免疫血清与疟原虫共同培养可使雄性配子体出丝减少,且动合子形成率显著下降。抗血清在1:10稀释的情况下,与截短蛋白免疫血清相比,全长蛋白免疫血清对雄性配子体出丝和动合子形成的阻断能力更明显,也表明抗Pb33抗体可阻止雄性配子体出丝和动合子的形成。体内实验中,与对照蛋白免疫组相比,r Pb33截短蛋白免疫组蚊感染率降低6.66%,卵囊密度减少了55.32%,r Pb33全长蛋白免疫组蚊感染率降低14.66%,卵囊密度减少了49.23%。体内实验结果显示:与对照组相比,抗Pb33免疫组蚊感染率及卵囊密度均有降低。抗血清可影响雄性配子体出丝、干扰动合子与卵囊的形成,降低蚊感染率,具有明显的传播阻断效应。结论:1.Pb33为保守的伯氏疟原虫蛋白,蛋白分子量为331aa,存在一个信号肽、一个低密度复杂区及多个跨膜域。2.Pb33主要表达于疟原虫的有性生殖阶段的配子体和动合子表面,对疟原虫血液阶段的发育未见影响。3.抗Pb33免疫血清对雄性配子体出丝、动合子和卵囊的形成均具有显著的阻断作用。4.与野生型疟原虫相比,Pb33基因敲除后雄性配子体出丝、动合子和卵囊形成完全抑制蚊感染率降低100%。本研究为Pb33作为TBVs候选抗原的后续研究提供了新的理论与实验依据。