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第一部分 环磷酰胺诱发大鼠卵巢早衰模型的构建和验证实验目的:环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)诱发大鼠卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)模型的构建和验证实验。方法:40只健康成年雌性SD大鼠(3-4月龄),从实验动物研究所购买。在21±2℃的环境温度下,在12/12 h的明暗循环下将动物圈养在无菌的聚丙烯大鼠笼中。随意提供食物和水。将大鼠随机分为两组以建立化疗诱导的卵巢早衰大鼠模型:对照组(健康成年雌性SD大鼠,腹腔注射等量生理盐水,n=20)和模型组(健康成年雌性SD大鼠,腹腔注射环磷酰胺,诱发大鼠卵巢早衰模型,n=20)。称重所有实验动物,并通过戊巴比妥(5μmg/100μg,腹膜内注射)麻醉。收集血液样本进行激素测定后,对大鼠实施安乐死。取出卵巢称重。通过HE染色进行大鼠卵巢组织病理学检查。通过流式细胞仪和细胞凋亡检测试剂盒检测卵巢颗粒细胞凋亡率。将每组10只大鼠在第8周进行正常的交配行为,统计每窝产仔数量。通过ELISA试剂盒检测卵泡刺激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH),黄体生成激素(Luteinizing Hormone,LH),雌二醇(Estradiol,E2)和抗穆勒氏激素(Anti-Muller hormone,AMH)水平。通过RT-q PCR检测卵巢中生殖细胞标记物DDX4,细胞增殖标记物PCNA,骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)4和原始卵泡活化的抑制剂FOXO3A m RNA的水平。通过生化分析大鼠卵巢中的氧化剂丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和抗氧化剂-谷胱甘肽(Glutathione,GSH),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GPx)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)水平。通过免疫印迹分析磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of Rapamycin,PI3K/Akt/m TOR)信号通路蛋白的磷酸化水平。结果:每组的大鼠体重在基线时无统计学差异。与对照组大鼠相比,模型组大鼠体重,卵巢重量和卵巢表面积均降低(P<0.05)。在对照组中观察到正常的组织学外观:黄体和次级卵泡,多层初级卵泡,原始卵泡。在模型组中,我们检测到血管充血,黄体周围出血和卵巢基质,滤泡闭锁,下方单核细胞浸润生殖上皮和卵巢基质。与对照组大鼠相比,模型组大鼠卵巢组织病理学损伤评分降低(P<0.05)。与对照组大鼠相比,模型组大鼠原始卵泡,初级卵泡,次级卵泡和成熟卵泡数量均降低(P<0.05)。与对照组大鼠相比,模型组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率增加(P<0.05)。与对照组大鼠相比,模型组大鼠每窝产仔数量降低(P<0.05)。与对照组大鼠相比,模型组大鼠FSH和LH水平增加(P<0.05),E2和AMH水平降低(P<0.05)。与对照组大鼠相比,模型组大鼠DDX4,PCNA和BMP4 m RNA的水平降低(P<0.05),FOXO3A m RNA的水平增加(P<0.05)。与对照组大鼠相比,模型组大鼠MDA水平增加(P<0.05),GSH,SOD,GPx和CAT水平降低(P<0.05)。与对照组大鼠相比,模型组大鼠p-PI3K,p-AKT和p-m TOR蛋白质水平增加(P<0.05)。结论:环磷酰胺可能通过增加PI3K,AKT,m TOR的磷酸化,调节血清AMH,E2,FSH,LH水平,调控氧化应激,增加卵巢颗粒细胞凋亡,减少原始卵泡,并影响卵巢早衰大鼠模型的生育能力。第二部分 鹿茸干细胞影响大鼠卵巢功能的分子机制目的:探究鹿茸干细胞影响大鼠卵巢功能的分子机制。方法:构建卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)大鼠模型后静脉注射鹿茸干细胞(ASCs),将POF卵巢与ASCs和/或GANT61共培养,FGSC用白消安和ASCs和/或GANT61预处理,并与ASCs预处理的M1巨噬细胞共培养。测量小鼠及其卵巢的重量以及卵泡数,评估卵巢功能,抗氧化应激,炎症和FGSC的存活率。结果:ASCs显著增加了POF大鼠及其卵巢的重量以及卵泡的数量,同时降低了卵泡的闭锁率。ASCs在体内和体外治疗后,检测到较高的Mvh、Oct4、SOD2、GPx和CAT水平。ASCs治疗导致卵巢中TNF-α和IL-6浓度明显降低,IL-10浓度明显升高。在FGSC中,治疗组的Mvh、Oct4和SOD2浓度较高,而TNF-α、IL-6和MDA浓度较低。ASCs通过Hh信号通路的封锁逆转了卵巢损伤。结论:ASCs通过减轻氧化应激和炎症反应以及涉及Hh信号通路的机制,有效改善了POF模型的卵巢功能和FGSC的生产能力,这表明ASCs治疗是抗POF的潜在疗法。第三部分 鹿茸干细胞对卵巢颗粒细胞的调控作用机制目的:探究鹿茸干细胞对卵巢颗粒细胞的调控作用机制。方法:实验中使用150~200 g的雌性SD大鼠(3~4周龄),将大鼠在室温23±2℃,湿度45-55%和光照12h的条件下饲养,从卵巢中分离出大鼠原发性卵巢颗粒细胞,鹿茸干细胞和颗粒细胞在37°C和5%CO2的含10%胎牛血清的α-MEM中联合培养。根据实验要求,将培养细胞分为对照组和联合培养组。通过CCK-8和流式细胞仪检测细胞的活力和凋亡。通过蛋白印迹分析丙二醛(Malondialdehyde,MDA),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),过氧化氢酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)等酶的蛋白表达。蛋白印迹分析转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β),成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)的蛋白表达。RT-PCR实时分析IL-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α、C-反应蛋白(reactive protein,CRP)、SIRT-1和ERK1/2的m RNA表达。结果:联合培养组较对照组细胞活力升高(P<0.05),细胞凋亡率和凋亡细胞数降低(P<0.05)。第12h细胞增殖比较无统计学差异(P>0.05),第24h、36h、48h和72h联合培养组较对照组细胞增殖升高(P<0.05)。联合培养组较对照组MDA酶蛋白表达降低(P<0.05),联合培养组较对照组SOD、CAT和GR蛋白表达升高(P<0.05)。联合培养组较对照组TGF-β、FGF和BMP的蛋白表达升高(P<0.05)。联合培养组较对照组IL-6、IL-1β、TNF-α和CRP的m RNA表达降低(P<0.05)。联合培养组较对照组Bax和caspase-3的蛋白表达降低(P<0.05),Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)。联合培养组较对照组SIRT-1和ERK1/2 m RNA表达升高(P<0.05)。结论:鹿茸干细胞能促进对卵巢颗粒细胞的增殖和分化,降低细胞凋亡的发生,保护细胞免于变性,可被认为是卵巢疾病的潜在治疗剂。第四部分 鹿茸干细胞对大鼠卵巢早衰功能修复的信号通路研究目的:探究鹿茸干细胞对大鼠卵巢早衰功能修复作用的信号通路。方法:购买48只SPF雌性SD大鼠(年龄12周;无出生;平均体重216.88±12.56g)。实验分三组:对照组(年龄相匹配的雌性C57BL/6大鼠未经诱导和治疗,n=16)、模型组(雌性C57BL/6大鼠环磷酰胺诱导,尾静脉注射60μL DMSO,n=16)和鹿茸干细胞组(雌性C57BL/6大鼠环磷酰胺诱导,尾静脉注射60μL第5代2×10~6鹿茸干细胞,n=16)。将鹿茸组织消化的复合物在含有10%胎牛血清,100μg/ml链霉素和100单位/ml青霉素的DMEM培养基中培养。每周记录每只大鼠的体重。通过ELISA试剂盒检查卵泡刺激素(Follicle-stimulating Hormone,FSH)、雌二醇(Estradiol,E2)、促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hormone,Gn RH)和抗穆勒氏激素(Anti-Muller hormone,AMH)水平。通过帕潘尼古拉染色法评估发情周期。通过HE染色评估三组中的卵泡数量。通过RT-q PCR检查TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA的表达水平。通过实时成像筛选尾静脉细胞移植后的无菌大鼠,以鉴定体内的GFP阳性细胞。通过免疫荧光染色追踪鹿茸干细胞。通过TUNEL染色检测凋亡。通过蛋白质印迹评估Caspase-3、Caspase-9、神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)、高亲和力神经生长因子受体(tropomyosin-related kinase,Trk A)和卵泡刺激素受体(Follicle Stimulating Hormone Receptor,FSHR)蛋白质的表达水平。统计各组大鼠的妊娠率和胚胎数。结果:与对照组相比,模型组3周和6周体重降低(P<0.05)。与模型组相比,鹿茸干细胞组3周和6周体重增加(P<0.05)。与对照组相比,模型组FSH水平升高,E2、Gn RH和AMH水平降低(P<0.05)。与模型组相比,鹿茸干细胞组FSH水平降低,E2、Gn RH和AMH水平升高(P<0.05)。移植后4周,鹿茸干细胞处理的动物和与未经处理的对照组动物观察到相似的发情前期、发情期、发情后期和休情期。但是,模型组动物的周期性不规律,发情周期更长或更短,并且在整个实验过程中动物都处于休情期。与对照组相比,模型组原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量降低(P<0.05)。与模型组相比,鹿茸干细胞组原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量增加(P<0.05)。与对照组相比,模型组TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA的表达水平升高(P<0.05)。与模型组相比,鹿茸干细胞组TNF-α、IL-1β和IL-6 m RNA的表达水平降低(P<0.05)。GFP(+)细胞在移植后6到12 h首先进入骨盆器官,在移植后24 h迁移到胸部。移植后2个月的卵巢组织基质中发现了GFP染色的细胞,GFP(+)染色与人类抗核染色在卵巢基质中共定位。与对照组相比,模型组3周和6周TUNEL阳性细胞的数量增加(P<0.05)。与模型组相比,鹿茸干细胞组3周和6周TUNEL阳性细胞的数量降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组Caspase-3、Caspase-9和FSHR蛋白质的表达水平升高,NGF和Trk A蛋白质的表达水平降低(P<0.05)。与模型组相比,鹿茸干细胞组Caspase-3、Caspase-9和FSHR蛋白质的表达水平降低,NGF和Trk A蛋白质的表达水平升高(P<0.05)。与对照组相比,模型组妊娠率和胚胎数量降低(P<0.05)。与模型组相比,鹿茸干细胞组妊娠率和胚胎数量增加(P<0.05)。结论:鹿茸干细胞通过调控NGF/Trk A信号通路,抑制炎症反应,降低细胞凋亡,可修复卵巢损伤,刺激再生并改善卵巢功能。干细胞移植可能为治疗卵巢早衰提供有效且新颖的方法。